實驗七質(zhì)粒DNA提取及鑒定第1頁/共15頁

實驗十質(zhì)粒DNA的快速提取及檢測第2頁/共15頁相關(guān)知識及原理質(zhì)粒(Plasmid)：獨立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子,大小可為1kb到200kb。存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。１９５２年由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。

第3頁/共15頁第4頁/共15頁質(zhì)粒有三種構(gòu)型：１、共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）；２、開環(huán)DNA（ocDNA）；３、線狀DNA。

這三種構(gòu)型的同一種質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，走的最快的是超螺旋構(gòu)型，其次是線狀構(gòu)型，最慢的是開環(huán)構(gòu)型。第5頁/共15頁質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：1、松弛型質(zhì)粒：復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，高拷貝數(shù)，獨立于細菌細胞而自主復(fù)制；２、嚴(yán)緊型質(zhì)粒：復(fù)制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，低拷貝數(shù)，隨細菌染色體的復(fù)制而同步進行。

質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。

第6頁/共15頁本實驗原理：

DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。第7頁/共15頁

SDS(十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導(dǎo)致細菌細胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性（NaOH）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而染色體DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而染色體DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細菌中提取出來。雜質(zhì)：蛋白質(zhì)、基因組DNA、RNA、糖第8頁/共15頁培養(yǎng)細菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基(含抗生素)，37℃培養(yǎng)12～16小時;（共5個樣品，CS,S1,S2,S3和5)取液體培養(yǎng)液1ml于1.5mlEppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液;再加入1ml于離心管中，10000r/min離心1min，去掉上清。加入100l質(zhì)粒提取液1，充分混勻;（震蕩懸浮菌體，放置5分鐘）加入200l新配制的質(zhì)粒提取液II（0.2mol/LNaOH，1％SDS)，加蓋顛倒6-7次使之混勻，放置冰上5分鐘;加入150l質(zhì)粒提取液III（乙酸鈉溶液，pH4.8)，加蓋后顛倒6-7次混勻，放置冰上5分鐘；（復(fù)性）質(zhì)粒小量提取的方法：第9頁/共15頁加入等體積酚-氯仿異戊醇，混勻；用臺式高速離心機，12000r/min離心5min，上清移入另一干凈離心管；加入等體積氯仿異戊醇，混勻，用臺式高速離心機，12000r/min離心5min，上清移入另一干凈離心管；在上清中加二倍體積無水乙醇（預(yù)冷），混勻，放置10分鐘，12000r/min離心2min，棄去上清液;沉淀用70％乙醇清洗一次，（離心12000r/min離心1min），小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，干燥;加入30lRTE緩沖液溶解提取物，37℃放置30min，使DNA充分溶解；將分離出的質(zhì)粒DNA進行電泳檢測或置于-20℃保存?zhèn)溆?。?0頁/共15頁注意：用移液器（俗稱“槍”）操作時，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA);加入溶液II和III后，一定不要劇烈振蕩，避免導(dǎo)致基因組DNA的斷裂而污染質(zhì)粒DNA！??！每取完一種試劑，必須換槍頭，避免造成污染。第11頁/共15頁電泳檢測－瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負電的核酸分子就可以向陽極遷移。影響DNA在瓊脂糖中遷移率的因素：DNA分子的大小、DNA的構(gòu)象、電壓、電場方向、堿基組成、嵌入的染料以及電泳緩沖液的組成。第12頁/共15頁EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽,(EthidiumBromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測?？梢詸z測10ng的DNA。注意：EB是一種誘變劑，操作時一定要注意安全操作，必須戴塑料或乳膠手套。第13頁/共15頁1.瓊脂糖凝膠制備：稱0.2g瓊脂糖粉，加入20ml0.5XTBE電極緩沖液，加熱融化，冷卻至50℃時，加入適量EB，混勻倒入鑄膠盤中，冷卻后凝膠即形成。(注：現(xiàn)在所用膠模每塊膠只需20ml即可)2.上樣電泳：取3-5ul提取產(chǎn)物加1ul上樣緩沖液(含指示劑)混合后，加到點樣孔中。接通電