微生物知識(shí)講座

一、微生物

1.1微生物基礎(chǔ)知識(shí)1.2微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基1.3微生物的代謝二、GMP相關(guān)微生物知識(shí)2.1什么是GMP2.2GMP對(duì)無菌操作方面的要求

三、ICHQ7A相關(guān)微生物知識(shí)3.1什么是ICHQ7A3.2ICHQ7A對(duì)無菌操作方面的要求微生物的分類 原核生物：細(xì)菌(狹義的)、放線菌、藍(lán)細(xì)菌、支原體、立克次氏體和衣原體。真核生物：真菌、顯微藻類和原生動(dòng)物等。非細(xì)胞微生物：病毒和亞病毒。原核生物細(xì)菌：細(xì)菌(bacteria)是一類細(xì)胞細(xì)短（直徑約0.5um，長約0.5um~5um），結(jié)構(gòu)簡單、胞壁堅(jiān)韌、多以二分裂方式繁殖和水生性較強(qiáng)的原核生物。放線菌：放線菌(actinomycetes)是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)的原核生物。放線菌放線菌與人類關(guān)系極其密切，絕大多數(shù)屬有益菌。至今已報(bào)道過的近萬種抗生素中，約70％由放線菌產(chǎn)生；本廠生產(chǎn)土霉素的龜裂鏈霉菌、生產(chǎn)新霉素的弗氏鏈霉菌、生產(chǎn)阿維菌素的除蟲鏈霉菌（也稱阿維鏈霉菌）都是放線菌的代謝產(chǎn)物。1.2微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基1.2.1、微生物細(xì)胞的化學(xué)組成1.2.2、六大營養(yǎng)要素及其生理功能1.2.3、培養(yǎng)基及其組成1.2.1微生物細(xì)胞的化學(xué)組成微生物細(xì)胞的化學(xué)成分（干物質(zhì)）以有機(jī)物和無機(jī)物兩種狀態(tài)存在。有機(jī)物包含各種大分子，它們是蛋白質(zhì)、核酸、類脂和糖類，占細(xì)胞干重的99%。無機(jī)成分包括小分子無機(jī)物和各種離子，占細(xì)胞干重的1%。水也是微生物細(xì)胞的重要組成成分，通常微生物細(xì)胞70%是水。幾種微生物的元素組成（干重%）元素細(xì)菌酵母霉菌C50~5345~5040~63H~7~7~7N12~157.5~117~10P2~30.8~2.60.4~4.5S0.2~10.01~0.240.1~0.5K1~4.51~40.2~2.5Na0.5~10.01~0.10.02~0.5Ca0.01~1.50.1~0.30.1~1.4Mg0.1~0.50.1~0.50.1~0.5（一）、碳源（Carbonsource）◆定義：能提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳源?！艄δ埽禾峁┖铣杉?xì)胞物質(zhì)及代謝物的原料;并為異養(yǎng)微生物生理活動(dòng)提供所需要能源?！舴N類:無機(jī)含碳化合物（無機(jī)碳源）：如CO2和碳酸鹽等。有機(jī)含碳化合物（有機(jī)碳源）：糖與糖的衍生物、脂類、醇類、有機(jī)酸、烴類、芳香族化合物以及各種含碳的化合物。微生物在元素水平上的最適碳源是：C·H·O型。糖類＞有機(jī)酸類＞醇類＞脂類單糖＞雙糖＞多糖己糖＞戊糖葡萄糖、果糖＞甘露糖、半乳糖；純多糖＞雜多糖；淀粉＞纖維素。淀粉酶配料中淀粉必須經(jīng)常淀粉酶水解方可使用。土霉素生產(chǎn)中所使用的淀粉酶為7658淀粉酶，這是一種α淀粉酶，其主要作用于葡萄糖單位的1、4糖苷鍵。淀粉酶加量并非越多越好，過量使用會(huì)使料液中還原糖高，從而光長菌絲不長單位。還原糖和非還原糖能夠還原斐林(H.vonFehling)試劑的糖稱為還原糖，所有的單糖，不論醛糖、酮糖都是還原糖。大部分雙糖也是還原糖，蔗糖例外。葡萄糖效應(yīng)。當(dāng)大腸桿菌培養(yǎng)于含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，菌體出現(xiàn)兩次生長旺盛期，這是菌首先利用葡萄糖進(jìn)行生長繁殖，在葡萄糖耗盡后，過一段時(shí)間菌體才開始利用乳糖。在上述培養(yǎng)基中即使加入乳糖酶誘導(dǎo)物，葡萄糖沒耗盡，利用乳糖的酶系也不能合成。碳分解產(chǎn)物的阻抑作用普遍存在于微生物的生化代謝中。（二）氮源（Nitrogensource）◆定義：凡用來構(gòu)成菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)源?！舴N類：無機(jī)氮源：銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、N2等；

有機(jī)氮源：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物（如胨、肽、尿素、氨基酸等）、牛肉膏、魚粉、花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿等。

◆功能：1）提供合成細(xì)胞中含氮物，如蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代謝物等的原料；2）少數(shù)細(xì)菌可以銨鹽、硝酸鹽等氮源為能源。培養(yǎng)基中氮源的利用蛋白氮必須通過水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被機(jī)體利用，這種氮源叫遲效氮源。無機(jī)氮源或以蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物形式存在的有機(jī)氮源可以直接被菌體吸收利用，這種氮源叫做速效氮源。速效氮源，通常有利于機(jī)體的生長，遲效氮源有利于代謝產(chǎn)物的形成。玉米漿是速效氮源，利于菌體生長；花生餅粉和黃豆餅粉是遲效氮源，利于代謝產(chǎn)物積累。微生物對(duì)銨鹽和硝酸鹽類氮源利用能力強(qiáng)，可直接吸收利用，是速效氮源。生理酸性鹽和生理堿性鹽銨阻遏銨分解產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用指的是被菌體迅速利用的氮源（特別是銨）能阻抑某些參與含氮化合物代謝的酶的合成。與葡萄糖效應(yīng)較為相似，在土霉素生產(chǎn)中，氨水與玉米漿的流加速度要適量，否則會(huì)影響抗生素的合成。磷以土霉素為例，培養(yǎng)中溶磷含量對(duì)菌體和效價(jià)單位有著相當(dāng)大的影響。在種子和發(fā)酵培養(yǎng)基中，溶磷主要存在于3種組份：玉米漿、高溫豆餅粉、磷酸二氫鉀。注：豆餅粉中的溶磷在炒制過程中，一部分分解為小分子物質(zhì)，可以被檢測(cè)出來。另一部分仍以各種有機(jī)大分子的形式存在，無法測(cè)量。培養(yǎng)基中溶磷的計(jì)算與實(shí)際測(cè)量：①豆粉中磷含量=豆粉(配比g/ml)×含量(ug/g)高溫黃豆餅粉磷含量參考值：2600ug/g②玉米漿磷含量=玉米漿(配比g/ml)×含量(ug/g)玉米漿干物質(zhì)磷含量的參考值：12000ug/g③磷酸二氫鉀中磷含量=227941×配比(g/ml)培養(yǎng)基中磷的總量(ug/ml)=①+②+③土霉素發(fā)酵培養(yǎng)基：理論計(jì)算，溶磷116，生化測(cè)定為92.6。磷酸鹽調(diào)節(jié)

磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的重要因素。過量的磷酸鹽也象葡萄糖一樣抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，這種抑制作用被稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中（以土霉素為例），補(bǔ)入磷源后，尾氣中CO2升高，活菌數(shù)升高。但補(bǔ)入過多，會(huì)使生長轉(zhuǎn)入初級(jí)代謝，從而影響效價(jià)增長。篩選耐受高磷酸鹽的生產(chǎn)用菌株，對(duì)于生產(chǎn)會(huì)有很大的幫助作用（例如在補(bǔ)料過程）。生長因子生長因子一類微生物生命活動(dòng)過程中調(diào)節(jié)微生物正常代謝所必需、需要量不大的、但不能用簡單的碳源或氮源自身合成的有機(jī)營養(yǎng)物。廣義生長因子維生素、卟啉、堿基、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物、C4~C6脂肪酸、營養(yǎng)缺陷型氨基酸狹義生長因子維生素生長因子來源酵母膏（yeastextract）、牛肉膏（beefextract）、麥芽汁（maltextract）、玉米漿（cornsteepliquor）、蔬菜汁、麩皮、米糠等。水1）溶劑和運(yùn)輸介質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)吸收及代謝物分泌2）參與細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)3）維持蛋白質(zhì)、核酸穩(wěn)定天然構(gòu)象4）熱的良好導(dǎo)體，控制細(xì)胞內(nèi)溫度變化5）維持細(xì)胞自身正常形態(tài)6）控制酶、微管、鞭毛等多亞基結(jié)構(gòu)組裝和解離1.2.3培養(yǎng)基（medium）◆定義：應(yīng)科研或生產(chǎn)的需要，由人工配制的、適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物用的營養(yǎng)基質(zhì)（混合養(yǎng)料）。◆用途：促使微生物生長；積累代謝產(chǎn)物；分離微生物菌種；鑒定微生物種類；微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)；菌種保藏；制備微生物制品?！羧魏闻囵B(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營養(yǎng)要素，且應(yīng)比例適當(dāng)！◆培養(yǎng)基一旦配成必須立即滅菌。培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用目的：是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產(chǎn)物？是實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵？代謝產(chǎn)物是初級(jí)代謝產(chǎn)物還是次級(jí)代謝產(chǎn)物？☆用于種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基營養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；☆用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基：氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低（若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時(shí)，有時(shí)還應(yīng)提高培養(yǎng)基的氮源含量）；☆大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基，應(yīng)重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價(jià)格，應(yīng)選擇來源廣泛、價(jià)格低廉的原料，提倡以粗代精，以廢代好。營養(yǎng)協(xié)調(diào)◆培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度濃度過高——微生物的生長起抑制作用，濃度過小——不能滿足微生物生長的需要?！舾鳡I養(yǎng)物質(zhì)之間的比例各營養(yǎng)要素之間比例（10倍遞減規(guī)律）H20＞C+能源＞N源＞P、S＞K、Mg＞生長因子10-110-210-310-410-510-6◆碳氮比（C/N）:直接影響微生物生長與繁殖及代謝物的形成與積累，故常作為考察培養(yǎng)基組成時(shí)的一個(gè)重要指標(biāo)；◆速效性氮（或碳）源與遲效性氮（或碳）源的比例。碳氮比（C/N）培養(yǎng)基分類用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營養(yǎng)應(yīng)豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；☆用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基其氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低，（但若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時(shí)，有時(shí)還應(yīng)提高培養(yǎng)基的氮源含量）；若代謝產(chǎn)物是次級(jí)代謝產(chǎn)物時(shí)要考慮是否加入特殊元素或特定的代謝產(chǎn)物；☆當(dāng)所設(shè)計(jì)的是大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價(jià)格，應(yīng)選擇來源廣泛、價(jià)格低廉的原料，提倡以粗代精，以廢代好。影響種子質(zhì)量的因素一、原材料質(zhì)量：如四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中配制孢子培養(yǎng)基的麩皮、瓊脂的牌號(hào)等。原料質(zhì)量的波動(dòng)，起主要作用的是其中的無機(jī)鹽含量的不同，如微量元素Mg、Ca、Ba能刺激孢子的形成。P含量的多少也影響種子的質(zhì)量。二、培養(yǎng)條件：溫度、pH值、濕度、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間都影響種子質(zhì)量。如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌的孢子，在北方干燥地區(qū)孢子斜面長的快，在含少量水分的試管斜面培養(yǎng)基中下部孢子長的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區(qū)，斜面孢子長的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。據(jù)資料記載，土霉素一般相對(duì)濕度40~45％時(shí)孢子數(shù)量最多，孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。培養(yǎng)基的pH值◆各類微生物的最適生長pH值各不相同細(xì)菌：7.0~8.0放線菌：7.5~8.5酵母菌：3.8~6.0霉菌：4.0~5.8◆在微生物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，培養(yǎng)基的初始pH值會(huì)發(fā)生改變?！魀H值調(diào)節(jié)方式內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值（最常見的如CaCO3）。外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要不斷向發(fā)酵液流加酸或堿液（如土霉素生產(chǎn)中流加氨水調(diào)節(jié)pH值變化）。微生物的生命活動(dòng)對(duì)環(huán)境pH值的影響配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題及解決方法混濁和沉淀膠體強(qiáng)度的破壞褐色物質(zhì)的形成pH發(fā)生變化泡沫可能與培養(yǎng)基中含有2價(jià)、3價(jià)金屬離子和可溶性磷酸鹽有關(guān)（加螯合劑）pH值降到4.5以下，瓊脂固體培養(yǎng)基滅菌后，瓊脂被熱水解而不再凝固，或凝固不堅(jiān)還原糖類、蛋白質(zhì)與氨基酸在高壓、高溫下相互作用的結(jié)果，“焦化”或美拉德反應(yīng)滅菌后pH會(huì)降低（糖分在高溫下分解為小分子的酸性物質(zhì)），在培養(yǎng)基滅菌前后加以調(diào)整加入消泡劑，適當(dāng)提高滅菌溫度或延長滅菌時(shí)間美拉德反應(yīng)：即葡萄糖與氨基酸所發(fā)生的系列化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的產(chǎn)物（如氨基糖）。小知識(shí)-輕鈣與重鈣輕鈣：又稱為沉淀碳酸鈣、沉降碳酸鈣輕質(zhì)超細(xì)碳酸鈣，俗稱輕鈣。是將石灰石等原料段燒生成石灰和二氧化碳，再加水消化石灰生成石灰乳（主要成分氫氧化鈣），通入二氧化碳碳化石灰乳生成碳酸鈣沉淀，經(jīng)脫水、干燥和粉碎制得。重鈣：就是方解石粉，是“重質(zhì)碳酸鈣”的簡稱，是礦石粉天然粉碎制的。1.3微生物的代謝1.3.1微生物的能量代謝1.3.2分解代謝和合成代謝的聯(lián)系1.3.3微生物的代謝調(diào)節(jié)與發(fā)酵生產(chǎn)

代謝概論新陳代謝(metabolism)：簡稱代謝,是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)的總稱。分解代謝合成代謝分解代謝（catabolism）

◆分解代謝：指細(xì)胞將大分子物質(zhì)降解成簡單的小分子物質(zhì)并產(chǎn)生能量的過程。1)多糖單糖丙酮酸/乙酰輔酶ACO2，H20，能量（三羧酸循環(huán)）2)蛋白質(zhì)氨基酸3)脂類甘油，脂肪酸合成代謝（anabolism）◆合成代謝：指細(xì)胞利用小分子物質(zhì)合成復(fù)雜大分子并消耗能量的過程。

◆合成代謝所利用的小分子物質(zhì)來源于分解代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物或環(huán)境中的小分子營養(yǎng)物質(zhì)。生物氧化及產(chǎn)能生物氧化：就是發(fā)生在活細(xì)胞內(nèi)的一系列產(chǎn)能性氧化反應(yīng)的總稱。氧化過程中能產(chǎn)生大量的能量，分段釋放，并以高能鍵形式貯藏在ATP分子內(nèi)，供需要時(shí)使用。底物氧化脫氫的四條主要途徑：EMP途徑、HMP途徑、ED途徑、TCA循環(huán)。前三種途徑是生物體將葡萄糖氧化成丙酮酸和其它小分子物質(zhì)，TCA循環(huán)是將丙酮酸徹底氧化成CO2和H2O并釋放出能量。據(jù)某些資料說添加微量的硫氰化芐可以抑制或者減弱TCA呼吸，從而使乙酰CoA更多的轉(zhuǎn)向次級(jí)代謝，從而提高土霉素產(chǎn)量。初級(jí)代謝與初級(jí)代謝產(chǎn)物初級(jí)代謝：能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)物質(zhì)、對(duì)機(jī)體具有生理活性作用的物質(zhì)或?yàn)闄C(jī)體生長提供能量的一類代謝。初級(jí)代謝產(chǎn)物：包括代機(jī)體進(jìn)行生物合成的各種小分子前體物、單體、多聚體以及在能量代謝和代謝調(diào)節(jié)中起作用的各種物質(zhì)。次級(jí)代謝與次級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝：存在于某些生物中并在它們一定生長時(shí)期內(nèi)出現(xiàn)的一類代謝類型。次級(jí)代謝產(chǎn)物：次級(jí)代謝的產(chǎn)物為次級(jí)代謝產(chǎn)物。是指某些微生物生長到穩(wěn)定期前后，以結(jié)構(gòu)簡單、代謝途徑明確、產(chǎn)量較大的初級(jí)代謝物作前體，通過復(fù)雜的次級(jí)代謝途徑合成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化學(xué)物。次級(jí)代謝產(chǎn)物一般具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、代謝途徑獨(dú)特、在生長后期合成、產(chǎn)量較低、生理功能不很明確，其合成一般受質(zhì)粒控制等特點(diǎn)。土霉素的生物合成生物合成見復(fù)印紙。土霉素的一些性質(zhì)：可以和鐵離子形成紅色絡(luò)合物?？梢院弯X離子形成黃色絡(luò)合物?？梢耘c鈣離子形成不溶性的鈣鹽，從而減少產(chǎn)物抑制。培養(yǎng)基中碳酸鈣的另一種用途。阿維菌素的生物合成新霉素的生物合成二、GMP相關(guān)微生物知識(shí)原料藥的發(fā)酵生產(chǎn)過程應(yīng)采取有效措施，避免微生物的污染。1、需接種、轉(zhuǎn)種或無菌添加培養(yǎng)基、緩沖液和氣體的，應(yīng)盡可能采用閉口或密閉的系統(tǒng)。如果接種、轉(zhuǎn)種或加料（培養(yǎng)基、緩沖液）需在容器敞口時(shí)進(jìn)行，應(yīng)有相應(yīng)控制措施，將污染的風(fēng)險(xiǎn)降到最小。2、原料藥質(zhì)量存在微生物污染風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，容器敞口的操作應(yīng)在生物安全柜中或者類似的控制環(huán)境中進(jìn)行。3、操作人員應(yīng)穿適宜的無菌工作服，并采取相應(yīng)措施處理培養(yǎng)物。4、關(guān)鍵操作參數(shù)（如溫度、pH、攪拌速度、通氣量、壓力）應(yīng)予監(jiān)控，確保與生產(chǎn)工藝規(guī)程一致。5、對(duì)菌體生長、活性、繁殖速率（必要時(shí)）也應(yīng)予監(jiān)控。6、非關(guān)鍵參數(shù)可不予監(jiān)控。7、發(fā)酵設(shè)備使用后應(yīng)清洗、消毒或滅菌。8、發(fā)酵用培養(yǎng)基必要時(shí)應(yīng)在使用前滅菌。9、發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)建立染菌處理程序，并保存污染的處理記錄。應(yīng)有合適的程序來檢測(cè)染菌，并決定糾偏措施。處理程序