第三章

酶的分離純化與保存酶的分離純化是酶學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)之一。針對(duì)化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的酶而言，其分離純化的方法主要沿用蛋白質(zhì)分離提純的方法。酶的分離純化又有其自身特點(diǎn)：難點(diǎn)：目標(biāo)酶在細(xì)胞中含量少優(yōu)勢(shì)：可通過(guò)測(cè)定酶活性的方法進(jìn)行示蹤酶的分離純化是一門(mén)實(shí)驗(yàn)科學(xué)酶的分離純化，就是將酶從細(xì)胞或者其他含酶的原料中釋放出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，而獲得符合研究和使用要求的酶制品的過(guò)程胞內(nèi)酶：在細(xì)胞中，酶在核糖體上合成后，即轉(zhuǎn)運(yùn)到各個(gè)作用部位，并不斷補(bǔ)充和更新胞外酶：合成后穿過(guò)質(zhì)膜，定域到質(zhì)膜外表面、周質(zhì)空間、外膜及細(xì)胞外環(huán)境中的酶不同的酶分離純化的方法不同：胞內(nèi)產(chǎn)物需經(jīng)細(xì)胞破碎，細(xì)胞碎片分離等步驟；胞外產(chǎn)物則將細(xì)胞去除后，對(duì)余下的液體即可進(jìn)行初步純化選用技術(shù)前，需考慮：1.目標(biāo)酶分子特性及其他物理、化學(xué)性質(zhì)2.酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異3.酶的使用目的和要求4.技術(shù)實(shí)施的難易程度5.分離成本的高低6.是否造成環(huán)境污染不同酶的分離、提純方法，主要根據(jù)：

酶分子之間各種選擇性的差異

分子大小和形狀

酸堿性質(zhì)

溶解度

吸收性質(zhì)

對(duì)其他分子的生物學(xué)親和力等等

酶的分離純化可以分為三個(gè)階段1、粗蛋白：多使用鹽析沉淀法，可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)；2、部分純化：使用各種層析法；3、均質(zhì)酶：目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，常用電泳或者色譜法。主要過(guò)程：細(xì)胞破碎酶的提取離心分離過(guò)濾沉淀層析電泳萃取濃縮干燥結(jié)晶保存。。。一、酶分子制備的前處理1、生物材料的選擇選擇目的酶含量高的選擇容易取材的利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和基因工程重組DNA技術(shù)。目前，酶的來(lái)源大都為來(lái)自微生物

動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?。如果所要求的成分在?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。植物要先去殼、除脂。微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。2、細(xì)胞的破碎將細(xì)胞和組織破碎，使酶分子（胞內(nèi)酶）充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞破碎方法。

機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎（酶解破碎）自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理物理法：反復(fù)凍融法：時(shí)間長(zhǎng)，需加蛋白酶抑制劑（PMSF、EDTA等）超聲波處理法：處理時(shí)間盡量短，避免局部過(guò)熱使得酶失活滲透壓法：冷熱交替法：JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)化學(xué)與生物化學(xué)方法自溶法：利用細(xì)胞自身酶系，保持一定pH和溫度條件，使細(xì)胞破壞有機(jī)溶劑處理法：通過(guò)有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，使得細(xì)胞破碎（Tween,Triton，氯仿等）酶解法：根據(jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，加適當(dāng)?shù)拿钙茐募?xì)胞壁，并在低滲溶液中使細(xì)胞破碎如：霉菌：幾丁質(zhì)酶,酵母細(xì)胞：β－葡聚糖酶

動(dòng)物細(xì)菌植物

∣研磨∣超聲波∣纖維素酶

∣勻漿∣溶菌酶∣

↓搗碎機(jī)↓化學(xué)溶劑(甲苯)↓

提取液

酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇Ｒ话阏f(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中（水、稀酸、稀堿、稀鹽溶液等），非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過(guò)程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。⑴鹽溶液提?。阂话阋缘望}溶液(0.05-0.2mol/L)為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。鹽溶：在低鹽濃度條件下，酶的溶解度隨鹽濃度增大而增大鹽析：當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定界限后，酶的溶解度隨著鹽濃度增大而降低(2)稀酸（堿）溶液提取在偏離等電點(diǎn)0.5左右，溶解度增大根據(jù)等電點(diǎn)，選擇合適的pH注意，不能采用極端pH值，操作時(shí)要注意避免局部過(guò)酸或過(guò)堿（4）

有機(jī)溶劑提取一些和脂類(lèi)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性，因此常用來(lái)提取與脂結(jié)合較牢或含非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)、酶和脂類(lèi)。酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶二、酶分離純化的基本技術(shù)（簡(jiǎn)介）溶解度：鹽析、沉淀分子大?。弘x心、凝膠層析、過(guò)濾電荷：離子交換層析、電泳親和性：親和層析萃取結(jié)晶等等(一)沉淀——根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的

溶解度不同而分離沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉酶分子制備中最常用的幾種沉淀方法

⑴中性鹽沉淀（鹽析法）：

⑵有機(jī)溶劑沉淀：

⑶選擇性沉淀⑷等電點(diǎn)沉淀：⑸有機(jī)聚合物沉淀：聚乙二醇中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。優(yōu)點(diǎn)是：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡(jiǎn)單、安全。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。

1、中性鹽沉淀在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱(chēng)為鹽析現(xiàn)象。中性鹽的選擇常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中最重要的是（NH4）2SO4：①溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度（酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行）

0℃20℃80℃100℃（NH4）2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101

②分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。

③不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L的(NH4)2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。

④可以分級(jí)沉淀:半飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿球蛋白，而飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿清蛋白。

⑤價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。影響鹽析的因素鹽飽和度的影響

不同的蛋白質(zhì)，所需的飽和度不同蛋白質(zhì)濃度的影響

在相同的鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀蛋白質(zhì)的濃度愈高，其它蛋白質(zhì)的共沉作用也愈強(qiáng)，分辨率降低，一般常將蛋白質(zhì)濃度控制在2～3％為宜pH的影響

但硫酸銨具腐蝕性且緩沖能力差，飽和溶液的pH值在4.5～5.5之間，使用時(shí)多用濃氨水調(diào)整到pH7左右。進(jìn)行鹽析時(shí)的pH，要選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的pI附近溫度的影響

在高鹽濃度下，它們的溶解度隨溫度的升高反而降低。另外，高溫還易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的鹽析一般在室溫下進(jìn)行。注意事項(xiàng)：添加固體時(shí)，要加粉末狀的鹽并且緩慢分批添加并緩緩攪拌，避免局部濃度過(guò)高且注意不要產(chǎn)生泡沫2、有機(jī)溶劑沉淀

有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等基本原理有機(jī)溶劑沉淀主要是降低水溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，削弱溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周?chē)乃瘜又袏Z走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用溶液介電常數(shù)的減少就意味著溶質(zhì)分子異性電荷庫(kù)侖引力的增加，使帶電溶質(zhì)分子更易互相吸引而凝集，從而發(fā)生沉淀。優(yōu)點(diǎn)：①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。缺點(diǎn)：對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。3、選擇性變性沉淀法利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱(chēng)為選擇性變性沉淀法。方法：加熱、大幅度改變pH，加有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇等）、加重金屬離子如Ag+

、Cu2＋、Pb2＋等、加有機(jī)酸如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過(guò)氯酸等及表面活性劑。4、等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法是利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。5、有機(jī)聚合物沉淀法有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的純化。應(yīng)用最多的是聚乙二醇(PEG)，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。作用機(jī)制不明。優(yōu)點(diǎn)：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。

（二）透析利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。袋內(nèi)：大分子量的生物大分子袋外：鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。（三）過(guò)濾過(guò)濾的分類(lèi)及其特性(根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)

類(lèi)別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜四種常用膜分離過(guò)程的截留特性超濾超過(guò)濾即超濾，超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不需增加任何化學(xué)試劑，尤其是超濾技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件溫和，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒(méi)有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。

缺點(diǎn)：不能直接得到干粉制劑。對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到10～50％的濃度。超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜。在生物大分子的制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。

（四）電泳電泳是指在電場(chǎng)的作用下，這些帶電顆粒向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳1、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱(chēng)為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，這一聚合過(guò)程需要有自由基催化完成。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）SDS(十二烷基磺酸鈉)--陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)舒展。并且每2個(gè)氨基酸與一個(gè)SDS結(jié)合，使得每個(gè)蛋白質(zhì)分子所帶電荷基本相同。這樣就消除了各種蛋白質(zhì)本身電荷上的差異，電泳遷移率只與蛋白質(zhì)分子量大小有關(guān)制備式電泳通常以不含SDS的原態(tài)disc

進(jìn)行，以便回收具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過(guò)部分純化，否則效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。有幾個(gè)方法可以鑒定蛋白質(zhì)的位置：(1)CoomassieBlue染色法;(2)活性染色;(3)UV照射呈像。定位后要把含有目標(biāo)酶的凝膠切出來(lái)，進(jìn)行電泳分離，獲得酶（五）離心離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。密度梯度區(qū)帶離心法（簡(jiǎn)稱(chēng)區(qū)帶離心法）差速離心法（六）層析層析法又稱(chēng)色譜法（Chromatography），是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱(chēng)為固定相)，另一個(gè)相則流過(guò)此固定相(稱(chēng)為流動(dòng)相)并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專(zhuān)一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離離子交換層析凝膠滲透層析親和層析--利用生物分子與配基之間所具有的專(zhuān)一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)酶與底物酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑酶與輔助因子抗原與抗體酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段（七）濃縮、干燥和結(jié)晶濃縮：低濃度高濃度離心、沉淀、吸水劑（PEG、硅膠等）蒸發(fā)濃縮：通過(guò)加熱或者減壓方法，使得溶液中部分溶劑汽化蒸發(fā)，常采用真空濃縮。酶高溫失活，一般在60℃以下，真空條件下進(jìn)行濃縮或干燥——真空干燥，另外還有冷凍干燥、噴霧干燥、吸附干燥、氣流干燥等。冷凍干燥將酶液降溫到冰點(diǎn)以下，使之凍結(jié)成固態(tài)，然后在低溫狀態(tài)抽真空，使冰升華，得到干燥的酶制劑酶質(zhì)量高，結(jié)構(gòu)完整，活力損失少，但是成本高，適合對(duì)熱敏感而價(jià)值較高的酶類(lèi)結(jié)晶結(jié)晶與沉淀的區(qū)別沉淀和結(jié)晶在本質(zhì)上同屬一種過(guò)程，都是新相析出的過(guò)程。兩者的區(qū)別在于構(gòu)成單位（原子、離子或分子）的排列方式不同在條件變化緩慢時(shí)，溶質(zhì)分子具有足夠時(shí)間進(jìn)行排列，有利于結(jié)晶形成；相反，當(dāng)條件變化劇烈，強(qiáng)迫快速析出，溶質(zhì)分子來(lái)不及排列就析出，結(jié)果形成無(wú)定形沉淀。由于只有同類(lèi)分子或離子才能排列成晶體，故結(jié)晶法具有高度的選擇性。

酶在結(jié)晶之前，酶液必須經(jīng)過(guò)純化達(dá)到一定的純度?？偟内厔?shì)是酶的純度越高，越容易進(jìn)行結(jié)晶。如果酶液純度太低，不能進(jìn)行結(jié)晶。通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在50%以上，方能進(jìn)行結(jié)晶。不同的酶對(duì)結(jié)晶時(shí)的純度要求不同。有些酶在純度達(dá)到50%時(shí)就可能結(jié)晶，而有些酶在純度很高的條件下也無(wú)法析出結(jié)晶。所以酶的結(jié)晶并非達(dá)到絕對(duì)純化，只是達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌榷?。常用方法：鹽析結(jié)晶、有機(jī)溶劑結(jié)晶、透析平衡結(jié)晶、等電點(diǎn)結(jié)晶等。三、分離純化方法的選擇及基本步驟生物大分子能否高效率地制備成功，關(guān)鍵在于分離純化方案的正確選擇和各個(gè)分離純化方法實(shí)驗(yàn)條件的探索。選擇與探索的依據(jù)就是生物大分子與雜質(zhì)之間的生物學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)上的差異。由本章前述的生物大分子制備的各種特點(diǎn)可以看出，分離純化方案必然是千變?nèi)f化的前處理：粗分離：細(xì)分級(jí)：結(jié)晶：生物組織破碎、溶解、離心分離無(wú)細(xì)胞提取液鹽析、等電點(diǎn)沉淀、超濾、有機(jī)溶劑分級(jí)層析、電泳精制品結(jié)晶或者凍干四、分離提純操作要求盡量減少酶活性的損失低溫0～5℃、有機(jī)溶劑：-15～-20℃抽提液加入EDTA（絡(luò)合金屬）抽提液加入巰基乙醇（防止含-SH酶失活）不能過(guò)度攪拌，以免產(chǎn)生大量泡沫，使酶變性pH值和鹽濃度的控制抗菌、抑菌測(cè)定酶的比活力⑴早期分離純化

特點(diǎn)：①粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜。②欲制備的生物大分子濃度很稀。③物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多。④希望能除去大部分與目的產(chǎn)物物理化學(xué)性質(zhì)差異大的雜質(zhì)。

對(duì)所選方法的要求：①要快速、粗放。②能較大地縮小體積。③分辨力不必太高。④負(fù)荷能力要大。

可選用的方法：吸附；萃??；沉淀法（熱變性、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等）；離子交換（批量吸附）；親和層析等。

⑵晚期分離純化可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。

注意的問(wèn)題：

①鹽析后要及時(shí)脫鹽。

②用凝膠過(guò)濾時(shí)如何縮小上樣體積，因?yàn)槟z層析柱的上樣體積只能是柱床體積的1/10～1/6，也可以使用串聯(lián)柱以加大柱床體積。

③必要時(shí)也可以重復(fù)使用同一種分離純化方法，例如分級(jí)有機(jī)溶劑沉淀，分級(jí)鹽析，連續(xù)兩次凝膠過(guò)濾或離子交換層析等。

④分離純化步驟前后要有科學(xué)的安排和銜接，盡可能減少工序，提高效率。例如吸附不可以放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過(guò)濾之前，因?yàn)殡x子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過(guò)柱交換容量即可。

⑤分離純化后期，目的產(chǎn)物的純度和濃度都大大提高，此時(shí)對(duì)于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續(xù)、緊湊，盡可能在低溫下（如在冷室中）進(jìn)行。

⑥得到最終產(chǎn)品后，必要時(shí)要立即冰凍干燥，分裝并寫(xiě)明標(biāo)簽，－20℃或－70℃保存五、酶的活力測(cè)定與純度測(cè)定1.酶的活力測(cè)定與比活性——評(píng)價(jià)提純方法好壞的指標(biāo)總活力的回收率反映提純過(guò)程中酶活力的損失情況比活力提高的倍數(shù)反映純化的效率在酶純化的每個(gè)階段，都需要進(jìn)行上述測(cè)定兩者合理安排，但通常不可兼顧，根據(jù)具體情況取舍。2.純度鑒定：方法很多，檢驗(yàn)是否還有繼續(xù)純化的必要由于酶分子高度復(fù)雜，不同方法檢驗(yàn)出的結(jié)果可能不同酶純度要注明：電泳純、層析純、HPLC純。鑒定依據(jù)：酶分子的大小、