第二章柱色譜法和紙色譜法

第一節(jié)

柱上色譜法柱上色譜可分為:柱上吸附色譜法、柱上離子交換色譜法、柱上分配色譜法、柱上凝膠色譜法。。柱上色譜法是比較古老的（1903年，Tswett提出來(lái)）。由于此法分離效率低，速度慢，因之在五十年代以前為主要的分離技術(shù)，但五十年代后，由于其它色譜技術(shù)（薄層色譜、氣相色譜）的出現(xiàn)，其應(yīng)用受到很大限制。但是由于此種方法所用設(shè)備和操作方法都比較簡(jiǎn)單，可處理大量樣品，在有機(jī)分析中，主要可用于有機(jī)樣品的提純（脫脂、脫色、脫膠、脫水），初步分離或制備純樣品等，因之該法仍然為人們所采用。此外，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)的發(fā)展，許多天然有機(jī)物的應(yīng)用價(jià)值日益提高，而這些化合物往往又難于合成，因之從天然界提取就成了唯一來(lái)源，這就必須采用制備型柱色譜技術(shù)。故柱色譜也是植物化學(xué)工作的主要技術(shù)之一。1．柱上吸附色譜法原理：按照各組分在吸附劑上的吸附能力大小來(lái)分離的。吸附劑的選擇（憑經(jīng)驗(yàn)決定）：一種合適的吸附劑應(yīng)該具備這樣一些條件：（1）它能夠可逆地吸附待層析的物質(zhì)；（2）它不會(huì)引起被吸附物質(zhì)的化學(xué)變化；（3）它的粒度大小應(yīng)該能使顯層劑以合適的速率流過(guò)；（4）吸附劑最好是白色的或淺色的，以便于對(duì)色層帶進(jìn)行觀察；（5）顆粒具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，操作時(shí)不易破碎；（6）不能與待分離物質(zhì)及流動(dòng)相產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，也不應(yīng)相互溶解。一般弱極性溶質(zhì)宜選用強(qiáng)極性吸附劑，而強(qiáng)極性溶質(zhì)宜用弱極性吸附劑。實(shí)驗(yàn)技術(shù)吸附劑的粒度及用量：一般在80~300目間變動(dòng)。粒度細(xì)，分離效果好，但速度太慢。吸附劑的用量，一般為樣品的30~50倍，有時(shí)達(dá)100倍。色譜柱：很簡(jiǎn)單，只需要一支適當(dāng)長(zhǎng)度、適當(dāng)口徑的玻璃管，管下口做一緊縮處及一斜口，再連一個(gè)吸濾瓶即可。柱長(zhǎng)與內(nèi)徑之比在10﹕1~4

﹕1間較好。裝柱方法有兩種：干法裝柱，將吸附劑由柱口裝入，邊裝邊輕敲打，以使吸附劑裝填密實(shí)均勻。吸附劑裝完后，把淋洗劑沿管壁輕輕加入，使之浸潤(rùn)吸附劑，淋洗劑加入后發(fā)現(xiàn)柱內(nèi)有氣泡時(shí)，可敲打柱體或施加適當(dāng)壓力以壓縮氣泡，使氣泡隨淋洗劑一起排出。濕法裝柱，有兩種操作方法：方法Ⅰ：先將柱體下端活塞擰死，向柱內(nèi)加入一定高度之淋洗劑，然后將吸附劑自上端慢慢加入，淋洗劑的液面一定要高出吸附劑層。吸附劑加完后，打開活塞，放出淋洗劑，直至吸附劑層不在沉降為止。方法Ⅱ：將吸附劑用淋洗劑調(diào)成糊狀，慢慢倒入柱中，在保證淋洗劑液面略高于吸附層條件下，讓淋洗劑自柱中慢慢流出，直至吸附劑沉降不在變動(dòng)為止。不論何種方法裝柱，要求裝好之柱體密實(shí)均勻，無(wú)氣泡，在淋洗過(guò)程中無(wú)裂紋出現(xiàn)，一般濕法裝柱比干法好。被分離樣品的準(zhǔn)備：柱色譜所用樣品溶液一般配成較濃的溶液，最好為飽和液，這樣樣品加到柱頂集中，分離效果好，配制樣品所用的溶劑極性要小，以利于樣品立即被吸附劑吸附。如果樣品在低級(jí)性的溶劑中溶解度很低，最好將樣品用一合適的溶劑溶解，再與吸附劑相拌，低溫烘干待上樣。上樣：樣品溶液配好后可開始加樣，方法為當(dāng)柱內(nèi)淋洗劑流至液面與吸附劑面相平時(shí)，將樣品溶液沿管壁加入柱內(nèi)，注意不要讓樣品溶液自由落下而打亂柱頂吸附劑層。當(dāng)樣品液面和吸附劑面相平時(shí)，用樣品溶劑數(shù)滴沿管壁加入，以洗凈管壁上的樣品液，當(dāng)液面與吸附劑面再次相平時(shí)，加入顯層劑進(jìn)行顯層。如果是和吸附劑相拌的樣品，將柱內(nèi)淋洗劑不要流至與吸附劑面相平，要保持一定的淋洗劑高度，將樣品粉末緩緩地加入，并輕輕敲擊柱子使氣泡充分地排除，加完樣品后，讓淋洗劑流至與吸附劑表面相平，用樣品溶劑數(shù)滴沿管壁加入，以洗凈管壁上的樣品液，當(dāng)液面與吸附劑面再次相平時(shí)，加入顯層劑進(jìn)行顯層。色層的分離方法：（1）推出法：將吸附劑自吸附管中推出，用小刀將各色層帶切開，分別用適當(dāng)溶劑提取，濾去吸附劑，將濾液濃縮就可以得到各組分。當(dāng)用這種辦法分離時(shí)，吸附柱玻璃管不能用下口緊縮的，而必須是兩頭都開的。（2）洗提法：待顯層后，用一種極性較強(qiáng)、吸附力較大的溶劑將各組分依次頂替下來(lái)，用幾個(gè)接收器分別接收流出的各個(gè)組分。這一步驟常稱為“洗提”。洗提用的溶劑稱為洗提劑。將各分洗提液分別濃縮即得到各組分。無(wú)色物質(zhì)層析時(shí)找出色層帶的方法：①將吸附柱系統(tǒng)地切斷，將各段逐一用溶液洗提，鑒定各洗提液中的物質(zhì)。②連續(xù)地洗提吸附柱，分別用接收器接收一定量的洗提液，然后鑒定各洗提液中的物質(zhì)。③層析完畢后，用顯色劑顯色。（常用的顯色劑下表）。④用紫外光照射，使能發(fā)熒光的物質(zhì)發(fā)生熒光。對(duì)于不發(fā)熒光的無(wú)色物質(zhì)，可以用發(fā)熒光的吸附劑。就是在普通吸附劑中加入某種能在在紫外光照射下發(fā)熒光的無(wú)機(jī)物（如硫酸鋅）或有機(jī)染料。該熒光染料不致降低吸附劑的活性，且在給定的吸附條件下又不會(huì)被洗提出來(lái)為宜。這時(shí)在柱上形成的色層帶相應(yīng)地改變了吸附劑原來(lái)的熒光的強(qiáng)度，借這種改變可以了解色層帶的位置。常用的熒光染料如桑色素（morin）用于三氧化鋁柱，小檗堿（berberine）用于硅膠柱，二苯基熒光吲啶磺酸（diphenylfluorin-dinesulfonesulfonicacid）及桑色素用于氧化鎂或氫氧化鈣柱。⑤制備有色衍生物，然后進(jìn)行色譜分析。

柱上層析常用的各種顯色劑*化合物顯色劑

烯

烴先用3mg藏紅溶于25mL水的溶液處理，然后用0.1mol/LKI溶液（加有4~5滴）處理，藏紅的原來(lái)顏色被漂白，但當(dāng)含有不飽和烴、砜、二芳基胺或三芳基胺存在時(shí)，色層帶上紅色重新出現(xiàn)。

醇類四個(gè)碳原子以上的醇可先用每升含200至300mg釩酸銨溶液處理，再用8-羥基喹啉溶于

6%的乙酸所成的2.5%的溶液處理。色層帶在暗綠色背景上顯橙棕色。酚類

1．香草醛溶于濃硫酸所成1%的溶液，色層帶顯淡紅至紅色。

2．重氮鹽溶液，色層帶顯黃至紅色。醛與酮類用2,4-二硝基苯肼飽和的2mol/L溶液，色層帶顯黃色，醛用希夫試劑處理，顯紫紅色。胺

1．四氯對(duì)醌在1,4-二氧六環(huán)中的飽和溶液是對(duì)脂肪胺的最好顯色劑，在橙色背景上色層帶顯綠色。

2．1%氟硼酸對(duì)硝基亞氮鹽水溶液是檢出芳胺色層帶的很有效顯色劑。色層帶呈橙至紅色，酚類也有同樣反應(yīng)。硫醇于7.5gNaOH在40mL水內(nèi)所形成的溶液中加入1.25gPbO作為顯色劑，如有黃色的色層帶出現(xiàn)，表示有硫醇存在，這時(shí)如再用硫在苯中的飽和溶液處理，色層帶即轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑梁谏?。硫醚?.5gKI溶于25mL水中，再加入兩滴2M氯化金溶液，作顯色劑，硫醚色層帶在粉紅色背景上顯棕至黑色，胺有同樣反應(yīng)，但胺的吸附力強(qiáng)，留在柱的上端，因此得與硫醚區(qū)別。芳環(huán)將10mL濃硫酸與0.2mL37%的甲醛溶液混合作顯色劑，單環(huán)芳烴顯紅的色帶。一般說(shuō)來(lái)，雙環(huán)或多環(huán)芳

烴顯綠色或藍(lán)綠色色層帶，此種溶液必須當(dāng)天配制。*本表所列各顯色劑是在以苯作為顯層劑，以硅膠作為吸附劑的情況下使用的，本表中各試劑的百分濃度，均指重量百分比。陽(yáng)離子交換樹脂一般為Na型（高分子鈉鹽）。使用前要用稀鹽酸浸泡處理為H型，然后進(jìn)行交換，以磺化交聯(lián)聚苯乙烯為例，再生和交換原理如下表示：此外還有交聯(lián)丙烯酸鹽或磷酸鹽等陽(yáng)離子交換樹脂。

陰離子交換樹脂一般為高分子的氯化季銨鹽化合物，稱Cl型，使用前要用稀堿處理為OH型，然后交換，以交聯(lián)聚苯乙烯氯化季銨鹽為例，其再生和交換如下：

此外，其它類型陰離子交換樹脂還有交聯(lián)丙烯酸仲銨型、叔銨型或季銨型。

2）裝柱：取一支400mm×10mm滴定管，下端放少許玻璃棉，關(guān)閉活塞，將處理好的樹脂倒入至150~200mm高度即可。由于每種樹脂都有一定的交換能力，一般每毫克干樹脂約可交換1~9mmol離子，但一般操作中，只需交換二分之一最大量即可。據(jù)此就可算出樹脂的用量及柱體的大小。6）舉例：A糖中除酸（葡萄糖中除去檸檬酸）向陰離子交換柱中通入糖液，則檸檬酸負(fù)離子被交換于樹脂上，排出糖液，則達(dá)到分離目的。樹脂用碳酸銨液洗提，則得檸檬酸銨溶液。然后樹脂再用NaOH液再生。B除去羰基化合物——異丙醇中除去少量丙酮。向陰離子交換柱中加入亞硫酸氫鈉液，則亞硫酸氫根負(fù)離子交換于樹脂上，用水洗至無(wú)堿性，然后通入異丙醇丙酮樣品，則丙酮與交換于柱上之亞硫酸氫根負(fù)離子加成而留于樹脂上，而余下之異丙醇則流出，從而達(dá)到分離目的。然后向柱中再通入稀NaCl液，則氯離子頂替出亞硫酸氫鈉和丙酮，完成洗滌任務(wù)，最后樹脂再于堿液中再生。離子交換色譜交換物質(zhì)量很小，只適于半微量樣品中微量雜質(zhì)的除去。另外一般要求樣品為水溶液時(shí)才好交換，而且交換下來(lái)的洗提液都很稀，組分回收困難，故對(duì)于樣品已處于很稀溶液時(shí)而且再無(wú)更好分離方法時(shí)才用此法。

紙上色譜法是分配色譜法中較常用的。最簡(jiǎn)單操作之一是取一條濾紙，懸掛在一個(gè)支架上，使它的底端浸入一盛有溶劑的淺皿中。在紙下端剛好高出液面部分用毛細(xì)管滴上一滴試液。將支架置于密閉容器內(nèi)，使紙周圍為溶劑蒸汽所飽和，靜置數(shù)小時(shí)，在這期間，溶劑由于紙上毛細(xì)管作用而沿濾紙上升。當(dāng)溶劑前沿升到快近紙條上端時(shí)，取下濾紙使之干燥。如果試液中的化合物是有顏色的，則紙上會(huì)顯出各組分斑點(diǎn)。較常見(jiàn)的情況是，層析的化合物是無(wú)色的，那么，待紙干燥后，于紙上噴以顯色劑而使化合物斑點(diǎn)顯色。上法為上行紙上色譜法。第二節(jié)紙上色譜法同理也有下行紙上色譜法。上行法一般需時(shí)間較多，但溶質(zhì)在兩相中的分配較易達(dá)到平衡。所以產(chǎn)生的斑點(diǎn)面積緊湊園整。組分易于分開。下行法快，省時(shí)間，對(duì)易分離化合物最好采用下行法。此外也可采用雙向紙上色譜法。紙上色譜法的Rf值，通常要受到下列因素的影響：（1）紙的質(zhì)量；（2）溫度；（3）化合物取量；（4）溶劑；（5）試樣原點(diǎn)與溶劑液面之間的距離。利用紙上色譜法的Rf值作為鑒定有機(jī)化合物的憑據(jù)時(shí)，最好用已知標(biāo)準(zhǔn)樣品在相同實(shí)驗(yàn)條件下，平行對(duì)照層析。如果兩者Rf值相同，方可斷定是同一物質(zhì)。為了使紙上色譜法得到正確結(jié)果，必須注意下列事項(xiàng)：①不要用手指直接接觸層析部分的濾紙，以防手上油漬染污濾紙。②濾紙必須剪平整。③濾紙周圍必須被溶劑蒸氣所飽和。否則就有可能當(dāng)顯層劑達(dá)到紙上某一處時(shí)，它的蒸發(fā)速度大于毛細(xì)管吸引速度，致使已經(jīng)分開的各組分重新在這里聚集。隨溶劑蒸氣壓的大小不同和層析缸的大小不同，使容器中充滿溶劑飽和蒸氣的時(shí)間可以由幾分鐘至數(shù)小時(shí)。某些有機(jī)化合物紙上層析所常用的溶劑和顯色劑化合物溶劑系統(tǒng)斑點(diǎn)顯色劑有機(jī)酸甲酸與下列溶劑混合：乙醇、丙醇-2，溴甲酚綠或溴酚藍(lán)在乙醇中的溶液。正丁醇及其它醇或酮酸的酰肼丙酮飽和的pH11.6的緩沖液化合物本身有色羥基及羰基酸甲苯-乙酸，正丁醇-丙酸氨及nessler試劑，鄰苯二胺及紫外光。羰基酸及一切正丁醇KOH溶液（10%）羰基酸化合物的2,4-二硝基苯腙有機(jī)酸的羥肟苯酚-異丁酸三氯化鐵

酸衍生物氨基酸苯酚、苯酚-氨，三甲吡啶，2,4-二甲水合三酮?dú)滠幔?.1~0.2%乙醇溶液）。吡啶，2-甲基吡啶，叔丁醇，正丁醇。含硫氨基酸叔丁醇鉑碘酸鉀水溶液氨基酸的2,4-二正丁醇-乙酸，三甲吡啶苯酚化合物本身有色硝基氟苯衍生物醇的2,4-二硝基甲醇-丙酮，甲醇-乙烷，丙醇-2，吡啶5%