第八章色譜分離ChromatographicResolution,CRChromatographicAnalysis,CA(色譜分析)紙層析實驗當濾紙接觸到溶劑時，溶液將上升。濾紙上的小圓點是4種不同的氨基酸的混合物?？纯唇酉聛頃l(fā)生什么事情…這就是紙層析法。對照上圖，可知道1-4號的各代表什么氨基酸。紙層析法是分離鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸組成的重要工具。

1234甘氨酸半胱氨酸組氨酸纈氨酸紙層析實驗紙層析小實驗動畫演示紙層析實驗動畫第一節(jié)概述是一種物理分離方法，利用多組分混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中。其中一個為固定相，一個為流動相。當多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動，使之分離。特點（1）分離效率高（2）應(yīng)用范圍廣（3）選擇性強（4）高靈敏度的在線檢測（5）快速分離（6）過程自動化操作（7）適用于價格昂貴的產(chǎn)品第二節(jié)色譜法的分類按分離機理不同分類5大類1、吸附色譜分離2、分配色譜3、離子交換色譜4、凝膠色譜5、親和色譜其他分類方法1、根據(jù)流動相的物態(tài)不同：氣相、液相、超臨界2、根據(jù)操作壓力不同：低壓、中壓、高壓3、根據(jù)洗脫操作時展開方式：迎頭法、頂替法、洗脫分析法分類總結(jié)分類原則類型特征據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機理不同吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠過濾親和色譜疏水作用色譜金屬螯合色譜共價作用色譜吸附力不同各物質(zhì)在兩液相間的分配系數(shù)不同各物質(zhì)與固定相之間的離子交換能力的不同各物質(zhì)的分子大小或形狀不同利用生物大分子與各種配基的生物識別能力不同各物質(zhì)與固定相之間的疏水作用的強弱不同各物質(zhì)與固定相上的金屬離子的絡(luò)合能力的不同巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同分類總結(jié)分類原則類型特征據(jù)實驗技術(shù)

低壓色譜中壓色譜高壓色譜電泳操作壓力小于0.5MPa操作壓力在0.5～5MPa之間操作壓力在5～40MPa之間溶質(zhì)分子在電場中的移動速度不同據(jù)固定相的形狀不同柱色譜紙色譜薄層色譜固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機玻璃柱中固定相為以氫鍵與纖維素羥基結(jié)合的水固定相在玻璃平板上鋪成薄層第三節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離色譜分離的規(guī)模4類：色譜分析：<10mg半制備：10~50mg制備:0.1~10g工業(yè)生產(chǎn):>20g/d色譜分離根據(jù)如下幾個方面選擇：（1）目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學特性及分子量的大?。唬?）主要雜質(zhì)；（3）目的產(chǎn)物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。（一）應(yīng)用色譜技術(shù)應(yīng)用范圍的不同（二）操作上的不同分析色譜：進樣量愈小愈好，檢測靈敏度越高越佳；制備及工業(yè)色譜：進樣量越多越好。（三）色譜分離理論上的不同1、理論塔板數(shù)的不同2、分配系數(shù)不同3、樣品保留值與峰高不同色譜分離圖示

色譜分離圖示

2、阻滯因數(shù)Rf=流動相（濃度中心）的移動速率/流動相在色譜柱中的移動速率=（r/R）r—溶質(zhì)（濃度中心）的移動距離R—在同一時間流動相（前緣）的移動距離0≤Rf≤1，Rf值越大，溶質(zhì)隨流動相移動的速率就越大，溶質(zhì)被洗脫的速率也就越快。3、塔板理論理論塔板高度是指自這段柱中流出的液體和其中固定相的平均濃度相平衡。二、吸附色譜根據(jù)吸附劑（固定相）對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的。離子交換色譜和親和色譜也可歸類于吸附色譜，前者主要是靜電引力的作用，而后者是生物專一親和力的作用。1、等溫曲線指一定溫度下溶質(zhì)分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相中濃度之間的關(guān)系曲線。Langmuir（朗謬爾）吸附等溫曲線（凸形線），如圖abc圖說明凸形吸附等溫線是液固系統(tǒng)中常見的一種，它反應(yīng)溶質(zhì)分子在固體表面達到飽和時形成單分子層吸附。凹形吸附等溫線表示在低濃度下已吸附分子又能吸附在液相中的分子，從而形成多分子吸附層。S形等溫曲線實際上是凸形與凹形兩種等溫曲線疊加的產(chǎn)物，它表示被吸附分子之間具有很長的作用力，能進一步吸附其他分子，而溶質(zhì)分子與固定相表面的作用力相對較弱。分離因數(shù)α某一瞬間被吸附溶質(zhì)量占總量的分數(shù)。0≤α≤1，α=0則溶質(zhì)不與固定相產(chǎn)生吸附作用，溶質(zhì)隨流動相以相同的速率移動；α=1則溶質(zhì)都被吸附在固定相上，且不隨流動相往下移動。有效的分離通常要求α至少為0.8三、凝膠色譜分離在生物大分子物質(zhì)制備與生產(chǎn)技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。原理示意圖（圖12-3）第五節(jié)柱色譜分離法1、層析劑含義：用于色譜分離技術(shù)中的固定相或分離介質(zhì)。由基質(zhì)和表面活性官能團組成。要求及種類要求：（1）不溶于流動相（2）化學穩(wěn)定（3）機械強度（4）大的表面積（5）粒度均勻?qū)游鼋橘|(zhì)種類無機（氧化鋁，硅膠，活性碳）有機（瓊脂糖，纖維素，聚丙烯酰胺）2、裝置一般由進樣、流動相供給、色譜柱、檢測及流分收集器等構(gòu)成，其中色譜柱是色譜分離裝置的關(guān)鍵部件。如圖圖流動相供給裝置一般包括貯液罐、高壓泵、液體混合室及梯度洗脫系統(tǒng)。高壓泵是流動相供給的關(guān)鍵設(shè)備。柱材料：常用玻璃柱裝柱的好壞對分離效果有很大的影響。（一次加完，平衡）檢測器與流分收集器在線檢測流分收集器是將底部流出的液體，每次按一定量分別收集的儀器，有滴數(shù)式、容量式、質(zhì)量式，其中后兩種方便，故常用。3、操作技術(shù)（1）樣品溶解與進樣方法制備合適的樣品溶液是成敗的關(guān)鍵之一活塞式進樣（2）展開操作樣品上柱后，加入洗脫劑，使樣品分離并收集目的產(chǎn)物，叫展開。下面介紹幾種方式：A、洗脫展開法應(yīng)用最廣的一種方法。先將樣品輸入柱，加入一種或幾種溶劑的混合物作流動相洗。物質(zhì)濃度流出液體積又分三種恒定洗脫法：不改變洗脫液的組成逐次洗脫法：洗脫液的組成至少改變一次梯度洗脫法：逐漸改變洗脫劑的組成梯度洗脫裝置洗脫時梯度曲線的形狀洗脫液濃度與洗脫液體積或洗脫時間的關(guān)系曲線稱為梯度曲線。通常先使用線性，然后改變?yōu)榘夹位蛲剐?。體積或時間洗脫劑濃度B、前沿分析法樣品本身起流動相的作用。不能將樣品中每個組分都分離回收，而只能得到其中作用力最弱的純物質(zhì)。AA+BA+B+CC、置換展開法又名頂替法或取代法。與洗脫展開法差別不大，主要不同是樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力極強的置換劑作為流動相。最先流出的是作用力最弱的。優(yōu)點缺點AB取代劑4、徑向色譜色譜柱的放大：（1）直徑不變，增加柱長（有限的）（2）柱長不變，加大直徑（目前常用，但分離效率會隨直徑的增加而下降）為解決這些問題，發(fā)展了徑向色譜。據(jù)報道，從實驗規(guī)模到大規(guī)模的多柱并聯(lián)可放大240倍。原理圖操作圖第六節(jié)親和色譜基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來進行分離的，是專門用于純化生物大分子的色譜分離技術(shù)。目前已成為純化生物物質(zhì)的一種主要方法。優(yōu)、缺點過程原理圖親和層析劑最大的問題是商品種類太少，幾乎每種生物大分子都需要合成其特殊的親和層析劑。制備過程：（1）