實(shí)驗(yàn)四蛋白質(zhì)的沉淀作用和等電點(diǎn)測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。2.了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。3.了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。4.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。5.掌握測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的基本方法。【實(shí)驗(yàn)原理】

一、沉淀作用

在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為可逆的沉淀反應(yīng)和不可逆沉淀反應(yīng)兩類。

（1）鹽析作用：用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的過程。在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質(zhì)分子的水化膜被剝奪；同時(shí)蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，因而破壞了蛋白質(zhì)溶膠的穩(wěn)定因素，使蛋白質(zhì)沉淀析出。但中性鹽并不破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因此，若除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白質(zhì)就會(huì)重新溶解。

（2）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：在蛋白質(zhì)溶液中加入適量丙酮或乙醇，蛋白質(zhì)分子的水化膜被破壞而沉淀。若及時(shí)將蛋白質(zhì)沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質(zhì)沉淀則可重新溶解于水中。

2.不可逆沉淀作用：一些物理化學(xué)因素往往會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，尤其是空間結(jié)構(gòu)破壞，因而失去其原來的性質(zhì)，這種蛋白質(zhì)沉淀不能再溶解于原來的溶劑中。重金屬鹽，生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、震蕩、超聲波和有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉定。二、等電點(diǎn)蛋白質(zhì)和氨基酸一樣都是兩性電解質(zhì)。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值，可使蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈或末端攜帶不同的電荷；在某一pH時(shí)其分子中的正電荷與負(fù)電荷數(shù)目相等，即凈電荷為零，該pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度往往較低容易沉淀析出。本實(shí)驗(yàn)借助觀察在不同pH溶液中的溶解度以測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)?！緦?shí)驗(yàn)材料和主要儀器、試劑】

1.實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)（卵清蛋白）、酪蛋白2.實(shí)驗(yàn)儀器試管及試管架；刻度吸管；吸耳球、膠頭滴管、pH試紙3.實(shí)驗(yàn)試劑

pH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液；3%硝酸銀溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結(jié)晶粉末；0.1mol/L鹽酸溶液；0.1mol/L氫氧化鈉溶液；0.05mol/L碳酸鈉溶液；0.1mol/L醋酸溶液；甲基紅溶液；0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液；醋酸溶液（mol/L）：1.0,0.1,0.01。

【實(shí)驗(yàn)步驟】（2）重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1～2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？【實(shí)驗(yàn)步驟】（3）某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。（4）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：取一支試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2mL95%乙醇。觀察沉淀的生成。

【實(shí)驗(yàn)步驟】（5）乙醇引起的變性與沉淀a.取3支試管編號(hào)，依下表順序加入試劑?！緦?shí)驗(yàn)步驟】2、酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定⑴取同樣規(guī)格的使館4支，按照下表順序分別精確加入各試劑，然后混勻。

⑵向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.3、4.7、3.5.觀察管溶液的混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。注：觀察時(shí)，用“＋”,“－”表示沉淀的多少。思考題及注意