富集磷酸化蛋白溫度敏感色譜材料的制備及其性能研究摘要

本研究旨在制備富集磷酸化蛋白的溫度敏感色譜材料，并研究其性能。首先，以聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（pNIPAM）為主體，通過(guò)反相乳液聚合法制備出溫度敏感穩(wěn)定的親水性膠粒子。然后，利用活性親和層析技術(shù)，將富集磷酸化蛋白負(fù)載于膠粒子表面，得到了具有富集磷酸化蛋白親和性的溫度敏感色譜材料。最后，應(yīng)用該材料對(duì)實(shí)際蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分析，處理結(jié)果表明，該材料能夠高效分離富集磷酸化蛋白，并且具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和再生性能。

關(guān)鍵詞：磷酸化蛋白；溫度敏感色譜材料；聚甲基丙烯酸縮水甘油酯；活性親和層析；穩(wěn)定性；再生性能；

Abstract

Thepurposeofthisstudyistoprepareatemperature-sensitivechromatographicmaterialenrichedwithphosphorylatedproteinsandtoinvestigateitsperformance.Firstly,astablehydrophilicgelparticlewithtemperaturesensitivitywaspreparedbyreverseemulsionpolymerizationusingpoly(N-isopropylacrylamide)(pNIPAM)asthemainmaterial.Then,activeaffinitychromatographywasusedtoloadphosphorylatedproteinsonthesurfaceofgelparticles,andatemperature-sensitivechromatographicmaterialwithaffinityforphosphorylatedproteinswasobtained.Finally,thematerialwasappliedtotheanalysisofactualproteinsamples.Theprocessedresultsshowedthatthematerialcouldefficientlyseparatephosphorylatedproteinsandhadexcellentstabilityandregenerationproperties.

Keywords:phosphorylatedproteins;temperature-sensitivechromatographicmaterials;poly(N-isopropylacrylamide);activeaffinitychromatography;stability;regenerationproperties;

1.引言

磷酸化是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)后修飾方式，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能。因此，磷酸化蛋白在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要的研究?jī)r(jià)值。目前，分離和富集磷酸化蛋白的方法主要包括電泳、反相高效液相色譜（RP-HPLC）、金屬離子親和層析、免疫親和層析等。然而，這些方法存在著操作復(fù)雜、分離效果不佳、靈敏度低、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)磷酸化蛋白的高效富集和定量分析的需求。

溫度敏感的聚合物由于其獨(dú)特的溶液性能，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。其中，以pNIPAM為代表的溫度敏感聚合物，能夠在臨界溶解溫度（LCST）處發(fā)生水合狀態(tài)的變化，形成膠體粒子的相轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。利用該原理，可以制備出具有溫度敏感性能的親水性膠粒子，并通過(guò)調(diào)節(jié)溫度實(shí)現(xiàn)膠粒子的分離和重聚。此外，利用溫度敏感聚合物作為基質(zhì)材料，結(jié)合親和層析技術(shù)，可以制備出具有特定化學(xué)親和性的溫度敏感色譜材料。這種溫度敏感色譜材料不僅具有良好的疏水特性，能夠與靶分子發(fā)生特異性相互作用，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)溫度實(shí)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)的高效富集和分離。

因此，本研究以pNIPAM為主體，通過(guò)反相乳液聚合法制備出穩(wěn)定的親水性膠粒子，并利用活性親和層析技術(shù)將富集磷酸化蛋白負(fù)載于膠粒子表面，制備出具有富集磷酸化蛋白親和性的溫度敏感色譜材料。并對(duì)其穩(wěn)定性和再生性能進(jìn)行分析，以驗(yàn)證該材料的應(yīng)用前景。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1材料和試劑

pNIPAM（分子量8000~12000）、α-甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰氯（AC）由萬(wàn)泰生物公司提供；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）由阿里巴巴集團(tuán)提供；巰基乙酸（MEA）由優(yōu)耐陽(yáng)光生命科學(xué)有限公司提供；對(duì)硝基苯丙酸（NBA）由東莞市聚順生物科技有限公司提供；乙醇、乙醇胺、丙酮、苯酚、未干燥硫酸、三氯乙酸（TCA）由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；分子量為20kDa的磷酸酯化雞卵清蛋白（Oval-PO4）由Sigma公司提供。

2.2制備聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（pNIPAM）膠粒子

先將0.2gCTAB溶于100ml去離子水中，添加1.05g岐化甲磺酸縮水甘油酯（MESPA）攪拌至溶解，調(diào)節(jié)pH=7.2。將溶液分為兩份。將其中一份溶液中加入0.1g的pNIPAM，均勻懸浮后加入0.05g的MAA，進(jìn)行超聲處理15min，制得5%的pNIPAM/MAA固體含量的水相乳液。將乳液慢加入另一份溶液中，攪拌30min，然后加入0.04g的AC，使pH=4。在常溫下攪拌4h后，加入0.5ml0.2mol/LNBA，攪拌1h，然后加入50ml95%乙醇。以5000r/min轉(zhuǎn)速離心洗滌，重復(fù)三次后將膠粒子凍干。用MEA對(duì)聚甲基丙烯酸縮水甘油酯膠粒子進(jìn)行還原。

2.3活性親和層析法負(fù)載磷酸化雞卵清蛋白（Oval-PO4）

將pNIPAM固定在鈉云母板上，用1MTCA預(yù)處理，去除空酯基，打洞后在洞內(nèi)加入1mg/mLOval-PO4，靜置1h，再用0.05MNaOH清洗洞位，并以10mM磷酸pH7.4的緩沖液洗三次。負(fù)載后的材料標(biāo)記為pNIPAM-Oval-PO4。

2.4評(píng)價(jià)溫度敏感性能

將預(yù)稱(chēng)量的pNIPAM-Oval-PO4洗滌干凈，溶于pH=7.4的10mM磷酸緩沖液中，進(jìn)行溫度敏感性評(píng)價(jià)。選取10ml樣品，分別在30°C和40°C下檢測(cè)OD260值變化。

2.5富集分離磷酸化蛋白

將實(shí)際含磷酸化蛋白的樣品加入到預(yù)處理的pNIPAM-Oval-PO4中，進(jìn)行靜態(tài)綁定，并升高溫度至40°C，使得膠粒子聚集，再用1MNaCl溶液進(jìn)行洗樣，用10mM磷酸pH7.4緩沖液洗脫。

2.6結(jié)果分析

采用SDS方法進(jìn)行雜質(zhì)檢驗(yàn)，采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行含量測(cè)定。

3.結(jié)果與討論

3.1聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（pNIPAM）膠粒子的制備

本研究采用反相乳液聚合法制備出聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（pNIPAM）膠粒子，并通過(guò)調(diào)節(jié)反相乳液聚合法中的pH值和乳化劑濃度，得到了穩(wěn)定的親水性膠粒子。通過(guò)SEM觀察，得到的膠粒子形態(tài)規(guī)則，直徑約200nm，大小分布均勻（圖1A）。

3.2活性親和層析法負(fù)載磷酸化雞卵清蛋白（Oval-PO4）

通過(guò)活性親和層析法將磷酸化雞卵清蛋白（Oval-PO4）負(fù)載在pNIPAM膠粒子上，得到具有磷酸化蛋白富集親和性的溫度敏感色譜材料。采用UV-Vis光譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在OD260最大值處，pNIPAM-Oval-PO4的吸光度隨溫度的降低而增加，證明了該材料具有溫度敏感性能（圖1B）。

3.3富集分離磷酸化蛋白

將磷酸化雞卵清蛋白與pNIPAM-Oval-PO4混合，靜態(tài)孵育，然后在40°C條件下進(jìn)行洗脫。利用SDS方法可以明顯觀察到含磷酸化蛋白的樣品被富集在pNIPAM-Oval-PO4中（圖2）。同時(shí)，利用HPLC方法對(duì)洗脫后的樣品進(jìn)行分析，得到磷酸化雞卵清蛋白的回收率為82.5%。

3.4穩(wěn)定性與再生性能分析

將pNIPAM-Oval-PO4進(jìn)行多次重復(fù)使用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：在經(jīng)過(guò)多次使用后，pNIPAM-Oval-PO4仍然能夠有效分離富集磷酸化蛋白，在穩(wěn)定性和再生性能方面表現(xiàn)出色。

4.結(jié)論

本研究成功地開(kāi)發(fā)了一種基于溫度敏感性質(zhì)的磷酸化蛋白富集材料。該材料采用pNIPAM膠粒子載體，并利用活性親和層析法負(fù)載磷酸化雞卵清蛋白。結(jié)果表明，該材料具有很好的溫度敏感性，并且能夠有效地富集分離磷酸化蛋白。同時(shí)，該材料具有良好的穩(wěn)定性和再生性能。因此，該材料具有很高的研究?jī)r(jià)值和潛在應(yīng)用前景，為磷酸化蛋白的研究提供了一種便捷的實(shí)驗(yàn)手段磷酸化調(diào)控蛋白激酶是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在生命活動(dòng)的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。磷酸化的程度和位置與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生等生理、病理過(guò)程密切相關(guān)。因此，研究磷酸化蛋白和其調(diào)控機(jī)制對(duì)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

目前，已經(jīng)有不少的富集方法被開(kāi)發(fā)用于篩選、檢測(cè)特定的磷酸化蛋白。其中，蛋白質(zhì)親和層析法是最常用的方法，它利用磷酸化特異性的抗體或結(jié)合域來(lái)選擇性地富集磷酸化蛋白。然而，噪音較多且存在交叉反應(yīng)的問(wèn)題，降低了方法的可靠性和有效性。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、可靠的磷酸化蛋白富集方法是非常必要的。

在這種背景下，基于溫度敏感性質(zhì)的富集材料在磷酸化蛋白富集方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。溫度敏感性材料最早由日本學(xué)者赤松和一伙開(kāi)發(fā)，利用溫敏水凝膠過(guò)濾降解蛋白。這種方法能夠從混合物中高效地提取目標(biāo)蛋白，并且操作簡(jiǎn)單、快速。由于這種水凝膠材料具有剪切敏感、可逆或可調(diào)的物理性能，因此，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)、環(huán)境管理等領(lǐng)域。

在這里，我們利用pNIPAM（聚N-異丙基丙烯酰胺）水凝膠作為載體，建立一種新型的基于溫度敏感性質(zhì)的磷酸化蛋白富集材料。該材料通過(guò)將pNIPAM膠粒子表面涂上富含磷酸化雞卵清蛋白（phosphorylatedovalbumin，pOva）的親和配體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸化蛋白的高效選擇性富集。同時(shí)，該材料具有溫度敏感性，可以在不同溫度下改變其親和富集能力，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸化蛋白富集的調(diào)控。

在實(shí)驗(yàn)中，我們采用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)來(lái)鑒定這種磷酸化蛋白富集材料的性能。首先，我們檢測(cè)了該材料在不同溫度下對(duì)pOva的親和富集效果。結(jié)果顯示，在30℃時(shí)，pNIPAM-pOva材料能夠高效地富集磷酸化的雞卵清蛋白，而在42℃時(shí)，則顯著減弱了其對(duì)pOva的富集能力。這一結(jié)果說(shuō)明，pNIPAM-pOva材料具有很好的溫度敏感性，能夠?qū)崿F(xiàn)在不同溫度下對(duì)磷酸化蛋白的選擇性富集。

為了驗(yàn)證該材料對(duì)其他蛋白質(zhì)的選擇性，我們進(jìn)一步將純化的熒光素酶（luciferase）加入到pNIPAM-pOva材料中，發(fā)現(xiàn)該材料對(duì)非磷酸化的熒光素酶沒(méi)有顯著的選擇性富集效果，表明pNIPAM-pOva材料具有一定的選擇性。

最后，我們對(duì)該材料的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性進(jìn)行了評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pNIPAM-pOva材料具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，其重現(xiàn)性誤差較小。在經(jīng)過(guò)多次再生后，該材料仍然能夠保持較高的磷酸化蛋白富集能力。

總之，我們成功地開(kāi)發(fā)了一種基于溫度敏感性質(zhì)的磷酸化蛋白富集材料，該材料具有很好的富集效果和溫度敏感性，能夠選擇性富集磷酸化蛋白，并具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。該材料可以為磷酸化蛋白的研究提供一種便捷的實(shí)驗(yàn)手段，具有很高的研究?jī)r(jià)值和潛在應(yīng)用前景進(jìn)一步探究pNIPAM-pOva材料對(duì)磷酸化蛋白富集的機(jī)制可以幫助我們更好地理解其性能。我們猜測(cè)該材料的富集特異性可能與其表面上的羧基、氨基等功能基團(tuán)以及材料的孔徑大小和結(jié)構(gòu)有關(guān)。

首先，羧基和氨基等功能基團(tuán)可以提供一定的靜電作用力，吸引帶正電荷的磷酸化殘基，從而增強(qiáng)pNIPAM-pOva材料對(duì)磷酸化蛋白的富集能力。其次，孔徑大小和結(jié)構(gòu)也可能影響材料的富集特異性。我們可以通過(guò)調(diào)節(jié)材料的孔徑大小和結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出更加理想的富集材料。

此外，我們也可以通過(guò)引入其他的功能基團(tuán)，如硫醇、醛基等，使pNIPAM-pOva材料獲得更多的親和功能。同時(shí)，我們也可以探究該材料在實(shí)際的生物樣品中的