常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)件第1頁/共21頁2教學(xué)目標(biāo)和要求1、掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。2、熟悉分光光度計的的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查和波長校正、原子分光光度計的類型和影響熒光分析的因素3、了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用。第2頁/共21頁3第一節(jié)光譜分析技術(shù)分光光度技術(shù)的基本原理分光光度計的基本結(jié)構(gòu)分光光度計的操作方法分光光度技術(shù)的定性和定量方法第3頁/共21頁4光譜分析技術(shù)原理：

利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法

吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光度法和紅外光譜法

散射光譜分析技術(shù)：比濁法

第4頁/共21頁5一、分光光度技術(shù)的基本原理（一）吸光度與透光度

A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I

當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T=I/I0T×100為T%稱為百分透光度。透光度的負(fù)對數(shù)稱為吸光度即：第5頁/共21頁6（二）Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。其表達(dá)式為：A=KLC

式中A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度（Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）第6頁/共21頁7

據(jù)Lambert-Beer定律，當(dāng)液層厚度為cm，濃度單位為mol/L時，吸光系數(shù)K稱為摩爾吸光系數(shù)(ε)。ε的意義是：當(dāng)液層厚度為1cm，物質(zhì)濃度為1mol/L時在特定波長下的吸光度值。ε是物質(zhì)的特征性常數(shù)。第7頁/共21頁8（三）偏離Lambert-Beer定律的因素

應(yīng)用Lambert-Beer定律產(chǎn)生誤差主要來源于光學(xué)和化學(xué)兩方面的因素。1．光學(xué)因素：

要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越大。

2．化學(xué)因素：

濃度、pH、溶劑和溫度等因素可影響化學(xué)平衡。

第8頁/共21頁9二、分光光度計的基本結(jié)構(gòu)最常用的是可見分光光度計和紫外-可見光分光光度計

光源單色器比色杯檢測器顯示器五大部份結(jié)構(gòu)：第9頁/共21頁10（一）光源光源定義：

指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長有明顯的變化。光源種類：可見光分光光度計常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。

紫外光光度計常用氫燈作為光源。第10頁/共21頁11（二）單色器定義：

將來自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。種類：濾光片棱鏡光柵第11頁/共21頁12（三）比色杯又稱為吸收池或比色皿材料：常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成

（五）顯示器（四）檢測器

檢測器是將透過溶液的光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將電信號放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。

是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。第12頁/共21頁13三、分光光度計的操作方法（一）分光光度計的基本操作以721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。2.將波長旋至測定的波長。3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關(guān)置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。5.將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.06.重復(fù)步驟4和57.將校準(zhǔn)液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A）第13頁/共21頁14（二）吸光度的校正

鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計的吸光度。在25℃，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/LKOH中，放入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度。第14頁/共21頁15四、分光光度技術(shù)的定性和定量方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法定性依據(jù)：最大吸收波長λmax和摩爾吸光系數(shù)ε2.摩爾消光系數(shù)ε方法1.最大吸收波長λmax方法第15頁/共21頁16（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法

根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，按最小二乘法的原理，將對應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過原點(diǎn)的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測溶液測定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。方法：第16頁/共21頁17制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：（1）測定條件發(fā)生變化時（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3）當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。（4）標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的條件完全一致。第17頁/共21頁182．比較法Cu=(Au×Cs)/As

己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為：

其中Cu和Au為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。第18頁/共21頁193．其它分析方法

包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。第19頁/共21頁20五、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（三）熒光光度