垂直板聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)電泳分離乳酸脫氫酶同工酶

（活性染色鑒定法）

1實(shí)驗(yàn)原理關(guān)于垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳關(guān)于連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)關(guān)于乳酸脫氫酶同工酶及酶活性染色2垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱之為電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)和加速劑N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，通過改變凝膠濃度及交聯(lián)度來調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，具有良好的分子篩效應(yīng)。它已成為目前生化實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。以它為支持物發(fā)展起來的各種聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，不僅能分離、小量制備生物大分子，而且可以用來研究生物大分子的性質(zhì)如電荷、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)以及構(gòu)象等。垂直板電泳將配制好的凝膠溶液注入到兩塊垂直放置的玻璃板之間聚膠，然后加樣進(jìn)行電泳。

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化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復(fù)性好。聚合反應(yīng)受各種因素的影響：?催化劑和加速劑的濃度應(yīng)選擇合適的AP和TEMED濃度使聚合時(shí)間控制在30—60min內(nèi)較好，過量的催化劑和加速劑會(huì)引起燒膠和蛋白質(zhì)條帶的畸變。?pHTEMED只能以游離堿的形式發(fā)揮作用，在酸性條件下，叔胺缺少自由堿基，引發(fā)AP產(chǎn)生自由基的過程會(huì)被延遲，聚合時(shí)間延長。?溫度聚合速度與溫度有關(guān)，一般是高溫聚合快，而聚合的速度影響交聯(lián)孔徑的大小，所以凝膠聚合時(shí)必須保持溫度恒定，通常用與電泳相同的溫度。?分子氧分子氧的存在會(huì)阻止碳鏈的延長，妨礙聚合作用，在聚合過程中要盡量避免接觸空氣。?雜質(zhì)某些金屬離子或其它雜質(zhì)也會(huì)影響凝膠的化學(xué)聚合，所以應(yīng)選擇高純度的Acr、Bis和AP。6

凝膠總濃度及交聯(lián)度對(duì)凝膠的影響

凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總濃度和兩者的比例是決定聚丙烯酰胺凝膠特性包括其機(jī)械性能、彈性、透明度、粘著度及孔徑大小的主要因素。T為凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總質(zhì)量濃度，C為凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。式中，a為丙烯酰胺單體的質(zhì)量(g)，b為交聯(lián)劑的質(zhì)量(g)，m為溶液的終體積(mL)。凝膠a、b的比例決定了凝膠的物理性狀。當(dāng)a:b小于10時(shí)，凝膠脆且硬，不透明，呈乳白色；當(dāng)a:b大于100時(shí)，即使用5%的丙烯酰胺凝膠也呈糊狀；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺濃度高于3%，凝膠富有彈性并且透明。7凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳

分離蛋白質(zhì)的原理

凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳是對(duì)天然狀態(tài)生物大分子進(jìn)行的電泳，目的是為了保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、其亞基之間的相互作用及其生物學(xué)活性。利用蛋白質(zhì)分子中所帶凈電荷、分子質(zhì)量、形狀的差異，在電場中泳動(dòng)的速度和方向不同，從而達(dá)到分離的目的。多數(shù)蛋白質(zhì)的pI在中性偏酸性范圍，通常是將樣品在堿性緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，以不同速度向陽極遷移，稱為陽極電泳；對(duì)于一些堿性蛋白，使用酸性緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)分子帶正電荷而向陰極遷移，稱為陰極電泳。9蛋白質(zhì)在凈電荷聚丙烯酰胺凝膠

電泳中的分離因素

電荷因素蛋白質(zhì)分子形狀和大小相同，所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量不同分子大小蛋白質(zhì)分子形狀和所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子大小不同分子形狀蛋白質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子形狀不同電荷因素分子大小分子形狀10聚丙烯酰胺凝膠電泳的類型

連續(xù)系統(tǒng)是指電泳系統(tǒng)采用相同孔徑的凝膠、緩沖系統(tǒng)等條件下進(jìn)行區(qū)帶電泳，是利用蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)進(jìn)行分離，凝膠的分子篩效應(yīng)不明顯，一般只用于分離一些比較簡單的樣品，缺點(diǎn)是分辨率不高。優(yōu)點(diǎn)是制膠簡單快捷，緩沖系統(tǒng)的pH恒定，可以防止樣品進(jìn)膠后因pH變化發(fā)生凝聚和沉淀，緩沖系統(tǒng)組成簡單。11關(guān)于乳酸脫氫酶1959年Markert等用電泳的方法將純化的心肌乳酸脫氫酶(LDH)分離出5條區(qū)帶，由陽極到陰極依次命名為LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它們均具有LDH催化活性，從而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亞基按不同比例組成的四聚體。LDH同工酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，動(dòng)物各組織中LDH同工酶各組分含量不同。臨床上對(duì)LDH及同工酶的檢測可作為某些疾病診斷的依據(jù)之一。13乳酸脫氫酶同工酶活性染色用活性染色對(duì)LDH進(jìn)行鑒定，將凝膠浸泡在活性染色液中，LDH與底物的反應(yīng)，用甲硫吩嗪(PMS)作為電子的中間載體，氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)作為最終電子受體，底物脫下的氫最后傳遞給NBT，NBT被還原后，產(chǎn)生藍(lán)紫色的不溶于水的物質(zhì)以對(duì)LDH定位。反應(yīng)式如下：14LDH4LDH3LDH5LDH1LDH21234電泳結(jié)果實(shí)例1517操作步驟一、樣品制備：斷脊椎處死小鼠，取適量小鼠骨骼肌、肝臟、心肌和腦組織，加入5倍組織重的勻漿緩沖液，用玻璃勻漿器勻漿，離心(10000r/min，15min)，吸出上清液，加入等體積40%的蔗糖（含少許溴酚藍(lán)）混勻，放置4℃冰箱中備用。

18二、制備凝膠：

凝膠模的組裝凝膠模由一塊玻璃板、一塊凹形氧化鋁板和兩條間隔條組成，將它們按下圖組裝，四周對(duì)齊，注意手指勿接觸玻璃和氧化鋁板內(nèi)側(cè)的灌膠面，注意間隔條的安裝。19將固定架安裝在底座上

將固定架置于凝膠模底座上，螺絲朝外，固定架兩側(cè)插入凸輪，凸輪旋轉(zhuǎn)180o使凝膠模的下緣在固定架的橡膠墊上壓緊，形成一個(gè)密閉的夾心式凝膠模。

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制膠(T=7.5%，C=2.6%)

兩組按照表中的比例和順序在小燒杯中配制凝膠溶液，加入AP后，立即混勻，沿玻璃板盡快倒入玻璃板和金屬板縫隙中，注意不要有氣泡，當(dāng)凝膠液面距短板（白金屬板）上緣0.3cm時(shí)，立即輕輕將樣品槽模板插入凝膠溶液中，注意樣品槽中不要有氣泡，凝膠溶液應(yīng)充滿樣品槽間隙。制膠裝置室溫垂直放置，30~60min聚合反應(yīng)完成。

22制備連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的配方

（兩組）

凝膠溶液組成體積Tris-Gly緩沖液5mL30%凝膠貯液2.5mL重蒸水（含TEMED）2.5mL10%AP60μL23

加樣取125mL電極緩沖液貯液，用去離子水稀釋到250mL，加入上、下緩沖液槽中，注意上槽液要高過凹形板，凝膠板與下液槽的縫隙處無氣泡。將印有樣品槽模板形狀的塑料片貼在玻璃板上，使其與樣品槽重合（加樣后電泳前將塑料片取下），小心拔出樣品槽模板。用微量進(jìn)樣器吸取一定體積的樣品溶液，小心地將樣品加在樣品槽底部。注意每種樣品使用同一支進(jìn)樣器，以免樣品相互污染。

25骨骼肌8μL心肌5μL肝臟3μL腦10μL

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附：制干膠

用兩張玻璃紙將凝膠制成夾心式干膠，待凝膠干透后，取下玻璃板即可得到平整透明的電泳干膠圖譜。凝膠玻璃板玻璃紙29其他注意事項(xiàng)愛惜電泳裝置