產(chǎn)酶微生物的分離與篩選第1頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三酶的生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(Chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample第2頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三Contentsofchapter22.1產(chǎn)酶微生物2.2產(chǎn)酶微生物的分離和篩選2.3產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育2.4產(chǎn)酶微生物原生質(zhì)體融合育種2.5基因工程育種第3頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.1常見產(chǎn)酶微生物基本要求：不是致病菌發(fā)酵周期短,產(chǎn)酶量高不易變異退化最好是產(chǎn)生胞外酶的菌種,利于分離。對醫(yī)藥和食品用酶,還應(yīng)考慮安全性：凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實驗。非常見微生物制取的酶,需做廣泛的毒性實驗,包括慢性中毒實驗。第4頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(1)大腸埃希氏桿菌，簡稱為大腸桿菌，是最為著名的原核生物。形態(tài)：短桿或長桿狀，0.5～1.0×1.0～3.0um，革蘭氏陰性，運動(周毛)或不運動，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。Escherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實驗室操作、生長迅速，而且營養(yǎng)要求低。應(yīng)用： 大腸桿菌能作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等第5頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(2)醋酸桿菌（Acetobacter）

菌體從橢圓至桿狀，單個、成對或成鏈，革蘭氏陰性，運動（周毛）或不運動，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長良好。應(yīng)用：有機(jī)酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿)山梨糖(維C中間體）第6頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(3)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。第7頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(4)根霉(Rhizopus)分類學(xué)上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。代表種：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。應(yīng)用：根霉能產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸。第8頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(6)曲霉(Aspergillus)分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門。分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。代表種：黑曲霉Asp.Niger、黃曲霉Asp.flavus應(yīng)用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種?；乇竟?jié)第9頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三菌種選育野生菌自發(fā)突變雜交育種原生質(zhì)體融合基因工程誘變育種2.2產(chǎn)酶微生物的分離與篩選第10頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.2.1樣品的采集根據(jù)所要分離的微生物的特點：纖維素酶：堆積和腐爛纖維素的地方—褐腐態(tài)樹木上果膠酶：霉?fàn)€的果蔬上淀粉酶：釀酒廠、淀粉廠周圍的土壤蛋白酶：肉質(zhì)、豆制品常廠的周圍不了解產(chǎn)酶微生物的具體來源—土壤第11頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.2.2富集培養(yǎng)添加特殊的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度控制培養(yǎng)溫度和熱處理添加抑制劑第12頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.2.3分離通常采用平板分離法。將含菌樣品用無菌水或生理鹽水稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，然后涂布在適當(dāng)?shù)钠桨迳?，根?jù)微生物的種類選擇培養(yǎng)條件。根據(jù)不同的微生物種類采用不同的培養(yǎng)基、抑制劑。第13頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三1.胞外酶的產(chǎn)酶菌株的篩選方法2.胞內(nèi)酶的產(chǎn)酶菌株的篩選方法如果是胞內(nèi)酶，則可采用以下兩種方法來確定：(1)固體培養(yǎng)法把菌種接入固體培養(yǎng)基中，保溫數(shù)天，用水或緩沖液浸泡培養(yǎng)基，將酶抽提，測定酶活力，這種方法主要適用于霉菌；(2)液體培養(yǎng)法將菌種接入液體培養(yǎng)基后，靜置或在搖床上振蕩培養(yǎng)一段時間(視菌種而異)，再測定培養(yǎng)物中酶的活力，通過比較，篩選出產(chǎn)酶性能較高的菌種供復(fù)篩使用。2.2.4初篩第14頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.2.4初篩通過平板分離的初篩法得到的產(chǎn)酶軍注重，需要進(jìn)一步復(fù)篩。復(fù)篩時可以采用幾種代表性的培養(yǎng)基，在預(yù)定的幾種培養(yǎng)條件下，對每一個菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并測定其產(chǎn)酶能力。由于同一種菌株可因培養(yǎng)方式的不同表現(xiàn)出不同的產(chǎn)酶能力，因此，最好將搖瓶實驗和小發(fā)酵罐實驗相結(jié)合判斷菌株的優(yōu)良性。第15頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.3產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育2.3.1優(yōu)良菌種的誘變育種誘變育種：是利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率大幅度提高，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實踐或科學(xué)研究用。1.誘變育種第16頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2

誘變育種方法

誘變育種的基本過程如下：選擇合適的出發(fā)菌株→制備待處理的菌懸液→誘變處理→篩選→保藏和擴(kuò)大試驗（1）出發(fā)菌株的選擇a.自然界直接分離到的野生型菌株b.經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株

c.已經(jīng)歷多次育種處理的菌株第17頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(2)制備菌懸液a.待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件。一般要求菌體處于對數(shù)生長期，并采取一定的措施促使細(xì)胞處于同步生長。b.菌懸液的細(xì)胞濃度一般控制為：真菌孢子或酵母細(xì)胞106～107個/ml，放線菌或細(xì)菌108個/ml。菌懸液一般用生理鹽水(0.85%NaCl)稀釋。表型延遲Phenotypiclag：所謂的表型延遲就是指某一突變在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在細(xì)胞表型上顯示出來，造成不純的菌落。生理性延遲現(xiàn)象：生理性延遲現(xiàn)象，就是雖然菌體發(fā)生了突變，并且突變基因由雜合狀態(tài)變成了純合狀態(tài)，但仍不表現(xiàn)出突變性狀。第18頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(3)誘變處理通常是根據(jù)經(jīng)驗選擇恰當(dāng)?shù)恼T變劑,對于已有誘變處理背景的菌株，變換使用其它誘變劑也許會得到較好的效果。要確定一個合適的劑量，常常需要經(jīng)過多次試驗。就一般微生物而言，突變率隨劑量的增大而增高，但達(dá)到一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。對于誘變劑的具體用量有不同的看法。有人認(rèn)為應(yīng)采用高劑量，就是造成菌體致死率在90%～99.9%時的劑量是合適的，這樣能獲得較高的正突變率，并且淘汰了大部分菌體，減輕了篩選工作的負(fù)擔(dān)。許多人傾向于采用低劑量(致死率在70%～80%),甚至更低劑量(致死率在30%～70%)，他們認(rèn)為低劑量處理能提高正突變率，而負(fù)突變較多地出現(xiàn)在偏高的劑量中。第19頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三誘變劑及其誘發(fā)機(jī)理1.物理誘變劑物理誘變主要是采用輻射。如紫外線、X射線、γ射線、激光和快中子等都是常用的物理誘變劑。生物中核酸物質(zhì)的最大紫外線吸收峰值在265nm波長處，該波長也是微生物的最敏感點。紫外線誘變機(jī)理是它會造成DNA鏈的斷裂，或使DNA分子內(nèi)或分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。第20頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三a.交聯(lián)是由二聚體引起的，二聚體可以在同一條鏈相鄰的堿基之間產(chǎn)生，也可以是在二條鏈的堿基之間形成。它會引起DNA復(fù)制錯誤，正常的堿基無法配對，造成錯義或缺失。嘧啶比嘌呤對紫外線敏感得多。第21頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三b.過量的紫外線照射會造成菌體丟失大段的DNA，或使交聯(lián)的DNA無法打開，不能進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而引起菌體死亡。

c.在正常的微生物細(xì)胞中，紫外線造成的DNA損傷是可以得到及時修復(fù)的。光復(fù)活作用(photoreactivation)：若將受紫外線照射后的細(xì)胞立即暴露在可見光下，菌體的突變率和致死率均會下降。光復(fù)活作用是因為微生物等生物的細(xì)胞內(nèi)存在光復(fù)活酶(photoreactivatingenzyme)。光復(fù)活酶會識別胸腺嘧啶二聚體，并與之結(jié)合形成復(fù)合物，此時的光復(fù)活酶沒有活性?？梢姽夤饽?300-500nm)可以激活光復(fù)活酶，使之打開二聚體，將DNA復(fù)原。與此同時，光復(fù)活酶也從復(fù)合物中釋放出來，以便重新執(zhí)行光復(fù)活功能.第22頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三暗修復(fù)(darkrepair)作用：可修復(fù)由紫外線、γ射線和烷化劑等對DNA造成的損傷。野生型大腸桿菌細(xì)胞的切除修復(fù)系統(tǒng)非但可以修復(fù)自身的DNA紫外線損傷，還能修復(fù)外來的噬菌體T1及T3等的DNA所受到的紫外線損傷。第23頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三重組修復(fù)(recombinationrepair)：重組修復(fù)必須在DNA進(jìn)行復(fù)制的情況下進(jìn)行，所以又稱為復(fù)制后修復(fù)。在不切除胸腺嘧啶二聚體的情況下，以帶有二聚體的這條鏈為模板合成互補(bǔ)單鏈，可是在每個二聚體附近留一空隙。對于重組修復(fù)的機(jī)制并不象切除修復(fù)了解得那樣具體，一般認(rèn)為通過染色體交換，空隙部位就不再面對著胸腺嘧啶二聚體而是面對著正常的單鏈，在這種條件下DNA聚合酶和連接酶便起作用把空隙部位進(jìn)行修復(fù)。第24頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.化學(xué)誘變劑(1)與堿基化學(xué)反應(yīng)的誘變劑:烷化劑、亞硝酸和羥胺烷化劑(alkylatingagent)：帶有一個或多個活性烷基，帶一個活性烷基稱單功能烷化劑，帶二個或多個的分別稱為雙功能或多功能烷化劑。它們的烷基可轉(zhuǎn)移至其它分子中電子密度高的位置，它們的誘變作用是其與DNA中的堿基或磷酸作用。常見的烷化劑有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、亞硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。堿基中的鳥嘌呤最易受烷化劑作用，形成6-烷基鳥嘌呤，并與胸腺嘧啶錯誤配對，造成堿基轉(zhuǎn)換。胸腺嘧啶被烷基化后，可與鳥嘌呤錯誤配對。第25頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三堿基類似物:有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5-FU)、8氮鳥嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP)它們與堿基的結(jié)構(gòu)類似，在DNA復(fù)制時，它們可以被錯誤地?fù)饺隓NA，引起誘變效應(yīng)，所以說它們引起堿基置換的作用是間接的。第26頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三移碼突變的誘變劑:吖啶類染料(原黃素、吖啶黃、吖啶橙及α-氨基吖啶等)和稱為ICR類的化合物移碼突變:是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的一類突變。由移碼突變產(chǎn)生的突變體稱為移碼突變體。作用機(jī)制：它們是一種平面型的三環(huán)分子，與嘌呤-嘧啶堿基對的結(jié)構(gòu)十分相似，故能嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開(兩個堿基對原來相距0.34納米，當(dāng)嵌入一個吖啶類分子時，就變成0.68納米)，從而在DNA復(fù)制過程中，會使鏈中增添或缺失一個堿基，結(jié)果引起移碼突變。第27頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三第28頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三突變是隨機(jī)不定向的，但是篩選是定向的。篩選的條件決定選育的方向，因為突變體高產(chǎn)性能總是在一定的培養(yǎng)條件才能表現(xiàn)出來。在一個適于突變株繁殖的特定條件下可以篩選得到具有新性狀的菌株，其他原養(yǎng)型菌株則逐步被淘汰。所以，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是決定菌種某些特性保留或淘汰的篩子。為了有效地篩選突變株，必須采用使新個體表型得以充分表達(dá)的篩選條件。首先要設(shè)計一個良好的篩選培養(yǎng)基和確定合適的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基無論從組成成分、濃度、配比、pH值都要有利于突變株優(yōu)良性狀的表現(xiàn)。同時，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件應(yīng)盡量力求和大生產(chǎn)條件一致，才能使選育的菌株應(yīng)用于工業(yè)大生產(chǎn)。2.3.2

突變株的分離與篩選第29頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三常規(guī)的篩選程序這是傳統(tǒng)選育中常用的方法，挑選的菌落直接接入搖瓶培養(yǎng)，產(chǎn)物用常規(guī)法測定。第一代：出發(fā)菌株誘變分離到平皿上（有時還結(jié)合指示劑，呈色劑或底物等）挑選菌落200個初篩1瓶/株50株復(fù)篩3~5株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）第二代：出發(fā)菌株4株誘變分離到平皿上（有時還結(jié)合指示劑，呈色劑或底物等）挑選菌100個菌落100個菌落100個菌落100個菌落初篩1瓶/株50株復(fù)篩3~5株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）第三代、第四代…直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株第30頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.簡便篩選程序在常規(guī)篩選法基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)：一方面分離在平皿上的菌落采用瓊脂塊法，每代誘變處理后打1000~3000塊瓊脂菌落，甚至更多。另一方面，初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物分析，采用簡便、快速的瓊脂平板測定法或其他簡便方法。第一代：出發(fā)菌株誘變分離在平皿上打瓊脂塊菌落1000~3000塊初篩１～２瓶／株３０～５０株檢定板上挑去５％～１０％透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落第二代：出發(fā)菌株４株誘變分離在平皿上打瓊脂塊1000~3000塊檢定板上挑?。担ァ保埃ネ该魅?、呈色圈、抑菌圈大的菌落初篩１～２瓶／株３０～５０株復(fù)篩３～５株（提供第二代誘變的出發(fā)菌株）復(fù)篩３～５瓶／株３～５瓶／株３～５株（提供第三代誘變的出發(fā)菌株第三代、第四代…直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株第31頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三第32頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2菌種篩選的手段有時，有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來。盡管相當(dāng)多的突變菌株并不存在這種相關(guān)性，但是在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。野生型變異菌株經(jīng)13代誘變后，所獲得的高產(chǎn)變株形態(tài)特征較原始的孢子顏色有灰綠變白色，菌落表面由松散變緊密，孢子量由多變少。從菌體形態(tài)變異分析第33頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三堿性脂肪酶變株FS-1884變異前后的菌落形態(tài)野生型變異菌株與野生菌相比，生長慢，分枝少。孢子多顏色深綠，菌落背面有一個約為菌落面積2/3大的象牙黃核區(qū)，該區(qū)隨著酶活性的提高逐漸變大。一個菌株的高產(chǎn)性能是經(jīng)過多代微小突變積累的，一代誘變后的菌落形態(tài)與直接親本之間形態(tài)變化一般不明顯。但是長期多代誘變后，高產(chǎn)菌株與其原始的親代在形態(tài)特征上還是有顯著差異的。根據(jù)形態(tài)挑選菌落，仍然具有隨機(jī)性，但是在淘汰大量的低產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上挑取約200個菌落，進(jìn)行搖瓶復(fù)證，這樣比直接搖瓶篩選法獲得高產(chǎn)菌株的概率要大。第34頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三

平皿快速檢測法平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的“形態(tài)”變化。具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初篩，但它們可以大大提高篩選的效率。它的缺點是由于培養(yǎng)平皿上種種條件與搖瓶培養(yǎng)，尤其是發(fā)酵罐深層液體培養(yǎng)時的條件有很大的差別，有時會造成兩者的結(jié)果不一致。（1）紙片培養(yǎng)顯色將飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片擱于培養(yǎng)皿中，用牛津杯架空，下放小團(tuán)浸有3%甘油的脫脂棉以保濕，將待篩選的菌懸液稀釋后接種到濾紙上，保溫培養(yǎng)形成分散的單菌落，菌落周圍將會產(chǎn)生對應(yīng)的顏色變化。第35頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三（2）變色圈法將指示劑直接摻入固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行待篩選菌懸液的單菌落培養(yǎng)，或噴灑在已培養(yǎng)成分散單菌落的固體培養(yǎng)基表面，在菌落周圍形成變色圈。在含淀粉的平皿中涂布一定濃度的產(chǎn)淀粉酶菌株的菌懸液，使其呈單菌落，然后噴上稀碘液，發(fā)生顯色反應(yīng)。變色圈越大，說明菌落產(chǎn)酶的能力越強(qiáng)。而從變色圈的顏色又可粗略判斷水解產(chǎn)物的情況。篩選果膠酶產(chǎn)生菌時，用含０.2％果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長成后，加入0.2％剛果紅溶液染色４h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌時，除了用酪蛋白外，還可以用吲羥乙酸脂為底物加到分離培養(yǎng)基內(nèi)，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸脂為3-吲羥吲哚，后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物，根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落。第36頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三（3）透明圈法在固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成渾濁、不透明的培養(yǎng)基背景。將待篩選在菌落周圍就會形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物質(zhì)的能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌時，培養(yǎng)基以淀粉為唯一碳源。要分離核算水解酶產(chǎn)生菌，可用雙層平板法，首先在普通平板培養(yǎng)基上把樣品懸浮液涂抹培養(yǎng)，等長出菌落后覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂，內(nèi)含3%酵母RNA，0.7%瓊脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，于42°C左右培養(yǎng)2~4h，四周產(chǎn)生透明圈的菌落，即為核酸分解酶產(chǎn)生菌。在分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時，也通常采用透明圈法進(jìn)行篩選。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。第37頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三搖瓶培養(yǎng)法（隨機(jī)篩選）搖瓶培養(yǎng)法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對培養(yǎng)液進(jìn)行分析測定。搖瓶與發(fā)酵罐的條件較為接近，所測得的數(shù)據(jù)就更有實際意義。但是搖瓶培養(yǎng)法需要較多的勞力、設(shè)備和時間，所以，搖瓶培養(yǎng)法常用于復(fù)篩。但若某些突變性狀無法用簡便的形態(tài)觀察或平皿快速檢測法等方法檢測時，搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。第38頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三原生質(zhì)體

植物或微生物細(xì)胞去掉壁以后的內(nèi)含物稱原生質(zhì)體。原生質(zhì)休融合育種是基因重組育種的一種重要方法。2.4產(chǎn)酶微生物原生質(zhì)體融合育種第39頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。原生質(zhì)體制備。等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進(jìn)一步試驗、保藏。生產(chǎn)性能篩選。

2.4.1原生質(zhì)體融合程序第40頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三1.標(biāo)記菌種的選擇獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。2.4.2原生質(zhì)體融合育種的關(guān)鍵第41頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶，將細(xì)胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。為何不用機(jī)械破壁呢？第42頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三3.影響原生質(zhì)體制備的因素菌體的前處理為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素。菌體的培養(yǎng)時間為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。酶濃度對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。第43頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三酶處理溫度(20—40℃)破壁時的pH值滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和KCl和NaCl等無機(jī)物。第44頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.4.3原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體融合就是把兩親本的原生質(zhì)體混合在一起，在物理的(電融合)或化學(xué)的(聚乙二醇)促融作用下，誘導(dǎo)細(xì)胞融合。目前在微生物菌體原生質(zhì)體融合中，報道最多的是聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合，也有一定數(shù)量的電場誘導(dǎo)融合。PEG的分子量隨乙二醇聚合數(shù)目不同而不同，在一定范圍內(nèi)，分子量越大，其促融效率越高，但毒性也越大。

第45頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三真菌融合常采用分子量4000～6000，動物細(xì)胞融合采用分子量1000的聚乙二醇。融合適宜pH值為7.0～7.5、鈣離子濃度為0.01～0.05M，PEG的使用濃度為35%，雙親原生質(zhì)體數(shù)量應(yīng)保證有107個/毫升。原生質(zhì)體融合時將兩種原生質(zhì)體懸液等體積混合，5000r/min離心后棄上清液，然后用巴氏吸管使其懸浮，用巴氏吸管滴入1毫升PEG，并邊加入邊輕輕搖動，1分鐘內(nèi)加完，30℃水浴，靜止促融10分鐘，離心除PEG，然后稀釋融合液涂布于再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。第46頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.4.3融合體和重組體的檢出重組融合子檢出方法包括直接檢出法和間接檢出法。①直接檢出法：根據(jù)親本菌株的遺傳標(biāo)記，直接篩選出融合子。如果兩親本菌株均為營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可將融合液涂布于基本培養(yǎng)基上，直接篩選出融合子。若為抗藥性標(biāo)記，可在補(bǔ)充二種藥物的培養(yǎng)基上，篩選出雙重抗藥性的重組子。第47頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三②間接檢出法：即將融合液涂布在營養(yǎng)豐富的再生平板上，使親本菌株和重組子都能再生，然后，再施加選擇因子檢出重組子。間接法雖然費時，但它可以克服某些有表型延遲作用的遺傳標(biāo)記因直接選擇而產(chǎn)生的干擾作用。第48頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三重組融合子揀出后，需對融合子進(jìn)行進(jìn)一步的。融合子的鑒定通常從以下幾個方面進(jìn)行綜合分析：①生物學(xué)特性分析（菌落形態(tài)、孢子形態(tài)及大小等）：鎖狀聯(lián)合是食用菌種內(nèi)雜交子所具有的特征，可以作為種內(nèi)是否融合成功的一個標(biāo)志，但作為種間融合子的標(biāo)志時不完全可靠。融合子菌株與雙親菌株在遺傳物質(zhì)組成上有差異，因此在對峙培養(yǎng)時，能產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，也是常用的鑒定方法。

第49頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三融合子若能形成子實體，可對子實體特征進(jìn)行鑒定以及對擔(dān)孢子進(jìn)行遺傳分析。另外，還可對融合子菌絲體進(jìn)行熒光染色，確認(rèn)融合子細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目。②生化指標(biāo)分析：主要從氨基酸、DNA百分含量及同功酶譜等方面進(jìn)行分析。第50頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三基因工程基本操作的四個步驟：1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定2.5基因工程育種的基本原理第51頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成第52頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三(一)從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1.基因文庫第53頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?第54頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.基因文庫的構(gòu)建方法①鳥槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA