第十二單元移植免疫學(xué)檢測演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有23頁\編輯于星期五（優(yōu)選）第十二單元移植免疫學(xué)檢測現(xiàn)在是2頁\一共有23頁\編輯于星期五器械

微量淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)板（泰薩奇板）、倒置熒光顯微鏡、微量移液器、吸管、溫箱、離心機(jī)、磁架等。試劑

淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll,γ＝1.077)、T/B淋巴細(xì)胞分離磁珠及洗滌液、凍干補(bǔ)體、熒光染色液、供者全血2~3ml（EDTA或ACD抗凝）、受者血清2ml、陰性對照血清（可用1640培養(yǎng)液或PBS替代）、陽性對照血清（抗全淋巴細(xì)胞抗體ALG/ATG）。實(shí)驗(yàn)器材和材料現(xiàn)在是3頁\一共有23頁\編輯于星期五淋巴細(xì)胞的分離（Ficoll法）：

1.將供者全血用PBS(pH7.4)緩沖液按1:1稀釋，混勻備用；2.取15ml離心管一支，加入一定體積的Ficoll液，用吸取稀釋后的供者全血，沿試管壁緩慢加入，使全血置于Ficoll上層。Ficoll液與稀釋后的全血體積之比為1:2；3.1500~2000rpm/min（半徑15cm水平轉(zhuǎn)子）離心10min；4.取出離心管，吸取中間白膜層，置于另一干凈離心管中；5.加入PBS，洗滌；6.2000rpm/min離心5min，傾出上清液；7.重復(fù)步驟5、6；8.PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×109/L。實(shí)驗(yàn)方法現(xiàn)在是4頁\一共有23頁\編輯于星期五淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)（一步法）1.于泰薩奇板每孔中加入5μl石蠟油，以防反應(yīng)物揮發(fā)；2.建立反應(yīng)格局，每位待測標(biāo)本均應(yīng)設(shè)立陰性對照、陽性對照；3.分別于各相應(yīng)孔中加入1μl淋巴細(xì)胞（混合淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）、1μl待測血清以及2μl補(bǔ)體；4.22~25℃溫度下孵育1h；5.熒光染色液染色并終止反應(yīng)。現(xiàn)在是5頁\一共有23頁\編輯于星期五結(jié)果應(yīng)在染色后10分鐘內(nèi)觀察，以防熒光猝滅。特殊情況不能立即觀察時(shí)，應(yīng)將反應(yīng)板用避光紙包緊，置于4℃冰箱中，盡早觀察結(jié)果。死亡細(xì)胞由于熒光染料進(jìn)入而呈紅色（染料中的EB與DNA結(jié)合），體積略為增大?；罴?xì)胞因?yàn)榧?xì)胞膜完整而呈明亮的綠色（染料中的CFDA與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合），具有強(qiáng)折光性。結(jié)果觀察現(xiàn)在是6頁\一共有23頁\編輯于星期五

根據(jù)死亡細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比來計(jì)分，目前普遍采用國際通用的NIH計(jì)分方法，如下表。判斷死細(xì)胞的百分比需要操作者具備一定的工作經(jīng)驗(yàn)，大致原則為：可疑2分，30為4，過半記6，強(qiáng)陽寫8。結(jié)果判斷現(xiàn)在是7頁\一共有23頁\編輯于星期五淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)記分標(biāo)準(zhǔn)死細(xì)胞（%）記分意義0～100陰性11～202陰性可疑21～404陽性可疑41～806陽性>808強(qiáng)陽性現(xiàn)在是8頁\一共有23頁\編輯于星期五1.每份標(biāo)本都必須設(shè)立陰、陽性對照；2.溫度過低有可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果；3.只有當(dāng)陰性和陽性對照結(jié)果準(zhǔn)確時(shí)，該實(shí)驗(yàn)的陽性和陰性結(jié)果方能成立。注意事項(xiàng)現(xiàn)在是9頁\一共有23頁\編輯于星期五淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)是測定患者機(jī)體內(nèi)是否含有特異性針對供者的淋巴細(xì)胞毒抗體，檢測的是HLA特異性的IgG和IgM抗體，包括HLA-I類抗體和II類抗體。由于混合淋巴細(xì)胞中主要為T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，而HLA-II類抗體在T淋巴細(xì)胞表面不表達(dá)，僅在B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，因而，利用混合淋巴細(xì)胞進(jìn)行CDC試驗(yàn)時(shí)，對HLA-I類抗體陰性、II類抗體陽性的患者，易產(chǎn)生漏檢，而造成這種結(jié)果的原因是由于混合淋巴細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例較少所致。為了更加真實(shí)、全面地反應(yīng)患者的免疫狀態(tài)，我們應(yīng)該如何改善上述局限性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響？南方醫(yī)科大學(xué)裘宇容實(shí)驗(yàn)討論現(xiàn)在是10頁\一共有23頁\編輯于星期五實(shí)驗(yàn)二群體反應(yīng)性抗體檢測現(xiàn)在是11頁\一共有23頁\編輯于星期五群體反應(yīng)抗體（Pannelreactiveantibody）是指存在于某些人體內(nèi)的抗人類白細(xì)胞(HLA)抗體，可通過輸血、輸血小板、妊娠以及器官移植等免疫途徑獲得。PRA測定即是檢測患者體內(nèi)是否存在HLA抗體、抗體的水平高低以及抗體特異性如何。PRA對于患者是否發(fā)生排斥、移植物的存活狀態(tài)以及器官功能的實(shí)現(xiàn)都有著不可忽視的作用。群體反應(yīng)性抗體的概念現(xiàn)在是12頁\一共有23頁\編輯于星期五實(shí)驗(yàn)原理將涵蓋不同地域、不同人種的HLA-I類和II類純化IgG抗原預(yù)先包被于泰薩奇微孔板中，與待測、血清反應(yīng)，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，孵育后加入酶作用底物，待顯色反應(yīng)完成后終止反應(yīng)。如果待測血清中存在HLA-I類抗體，則相應(yīng)的HLA-I類混合抗原孔中會(huì)發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，反應(yīng)孔呈現(xiàn)藍(lán)色的陽性反應(yīng)結(jié)果；若無相應(yīng)抗體，則反應(yīng)孔中為無色陰性結(jié)果。現(xiàn)在是13頁\一共有23頁\編輯于星期五器械：各種移液器、吸頭、溫箱、離心機(jī)、微量酶標(biāo)儀等。試劑：抗原微孔板（以LATmixtray為例）對照血清（10×serumcontrol）去離子水(steriledeionizedwater)酶標(biāo)二抗（100×alkalinephosphatase-conjugatedanti-humanIgG)抗體稀釋液（1×antibodydiluent）洗液（10×washbuffer）底物A和B（1×colorimetricenzymesubstrateA&B）反應(yīng)終止液（1×stopreagent）實(shí)驗(yàn)器材和材料現(xiàn)在是14頁\一共有23頁\編輯于星期五試劑準(zhǔn)備1.在第一次使用時(shí)，至少提前20min取出凍干對照血清以2ml去離子水輕輕搖震使其徹底溶解。將溶解后的對照血清溶液分裝，每管100μl，儲(chǔ)存在-20℃冰箱中，每次實(shí)驗(yàn)前取出，恢復(fù)至室溫后使用；2.將洗液用去離子水(steriledeionizedwater)按1：9稀釋，可根據(jù)工作頻率一次性配制一定量的工作液，4℃冰箱貯存?zhèn)溆茫?.將待測標(biāo)本用抗體稀釋液（antibodydiluent)按1：2稀釋，約60μl/test；4.酶標(biāo)二抗（alkalinephosphatase-conjugatedanti-humanIgG)在第一次洗滌之前用抗體稀釋液按1：100稀釋，50μl/test；5.底物A、B(colorimetricenzymesubstrateA&B)在第二次洗滌之前按1：1比例混勻，50μl/test。實(shí)驗(yàn)方法現(xiàn)在是15頁\一共有23頁\編輯于星期五酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)1.根據(jù)反應(yīng)格局表，將待測血清和各種對照品加入相應(yīng)的孔中，每孔10μl（陰性對照孔加入抗體稀釋液，陽性對照孔和質(zhì)控孔加入對照血清）；2.蓋好反應(yīng)板，22~25℃孵育60min；3.用力將反應(yīng)板中的血清甩出，并在墊有紙巾的實(shí)驗(yàn)臺面上叩擊反應(yīng)板兩至三次，在加入下一液體前，請注意加蓋，保持反應(yīng)孔濕潤；4.于每孔中加入洗液(washbuffer)20～-30μl，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板，甩出洗液，叩擊反應(yīng)板兩至三次；5.再重復(fù)步驟9兩次；6.加入10ul酶標(biāo)二抗，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板,22~25℃孵育40min；7.重復(fù)步驟9三次；8.每孔加入10μl混合好的底物，37℃避光孵育10~15min（一般不要超過15min）；9.待質(zhì)控孔和陽性對照變成深藍(lán)色后,每孔加入5μl終止液(stopreagent)，蓋上反應(yīng)板，15分鐘后觀察結(jié)果?，F(xiàn)在是16頁\一共有23頁\編輯于星期五肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，藍(lán)色或深藍(lán)色為陽性,無色為陰性，陽性結(jié)果的顏色深淺程度與待測標(biāo)本HLA抗體水平的高低成正比。有條件時(shí)可在微量酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，并根據(jù)陰、陽性對照的吸光度值判定標(biāo)本的陰、陽性。盡量在顯色終止反應(yīng)后1小時(shí)內(nèi)讀取反應(yīng)結(jié)果，上機(jī)前請移去反應(yīng)板蓋。如因特殊情況需延遲觀察結(jié)果時(shí)，請將反應(yīng)板貯存于2~5℃冰箱中，此情況下可能會(huì)引起反應(yīng)孔吸光度值降低，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。觀察結(jié)果現(xiàn)在是17頁\一共有23頁\編輯于星期五注意事項(xiàng)洗滌洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的步驟，如洗滌不充分，則可能出現(xiàn)本底過高的現(xiàn)象；但洗滌過度，亦可能丟失一些陽性反應(yīng)；溫度除二抗反應(yīng)過程外，本實(shí)驗(yàn)以22~25℃為宜，溫度過高或過低都會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同性質(zhì)的干擾；對于強(qiáng)陽性標(biāo)本，可加大稀釋倍數(shù)后再進(jìn)行檢測；本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)為陽性結(jié)果的評價(jià)和判斷，因此，如果操作者具備豐富的HLA專業(yè)基礎(chǔ)知識，將會(huì)大大提高本實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷的可靠性和準(zhǔn)確性?，F(xiàn)在是18頁\一共有23頁\編輯于星期五結(jié)果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件不同，各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果具有不同的波動(dòng)范圍；2.當(dāng)空白對照、陰性對照、陽性對照以及質(zhì)控孔的OD值均在試劑盒可接受范圍時(shí)，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠；3.肉眼判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)根據(jù)反應(yīng)孔的顏色深淺計(jì)分，計(jì)分方法同“微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)”，以0，2，4，6，8分來表示反應(yīng)由弱至強(qiáng)的程度。4.對于HLA混合抗體檢測，建議4分以上為陽性。對于2分結(jié)果的定義是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)，應(yīng)結(jié)合患者機(jī)體免疫狀態(tài)而定。結(jié)果分析現(xiàn)在是19頁\一共有23頁\編輯于星期五Cut-off值的確定不同的HLA抗體檢測試劑盒，可設(shè)置不同的調(diào)節(jié)Cut-off值，建議在HLA抗體初篩時(shí)適當(dāng)下調(diào)Cut-off值；對于HLA抗體特異性及抗體水平的檢測，可根據(jù)試劑盒類型（LAT1240/1288/1HD/240）相應(yīng)上調(diào)Cut-off值。調(diào)節(jié)Cut-off值的計(jì)算：調(diào)節(jié)Cut-off＝〔（陽性孔均值－空白均值）×校正系數(shù)〕＋空白均值PRA值的計(jì)算PRA＝陽性孔數(shù)/總檢測孔數(shù)×100%現(xiàn)在是20頁\一共有23頁\編輯于星期五南方醫(yī)科大學(xué)裘宇容如孔2A~2E均為陽性，根據(jù)反應(yīng)工作表格局，說明抗體特異性為抗HLA-A1抗體；如孔2A~2E中有3孔強(qiáng)陽性，而2孔陰性，應(yīng)該如何分析？實(shí)驗(yàn)討論現(xiàn)在是21頁\一共有23頁\編輯于星期五實(shí)驗(yàn)三病例討論現(xiàn)在是22頁\一共有23頁\編輯于星期五病歷

患者吳xx,女性，39歲，漢族，廣東省汕頭籍，家住汕頭市鱸崗鎮(zhèn)，2007年5月18入院。主訴：尿檢、腎功異常6年，加重半年。緣于2001年5月無明顯誘因出現(xiàn)頭暈，腰酸痛，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，査尿常規(guī)提示尿蛋白（++），腎功異常（肌酐130umol/L左右），給予對癥治療（具體不詳），癥狀緩解。此后病情平穩(wěn)。監(jiān)測腎功肌酐逐步上升，2006年9月為200