動物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.5動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：是指將原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。細(xì)胞的體外大量增殖以及細(xì)胞系的建立是通過傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的。通常情況下，傳至5~10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為次代培養(yǎng)細(xì)胞，傳至10~20代以上的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞系。

動物細(xì)胞體外培養(yǎng)：組織獲得與消化、接種、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)一般情況下，當(dāng)傳至10～50代后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，最終完全停止，之后進(jìn)入衰退期。第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三動物細(xì)胞培養(yǎng)過程生長曲線第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.5.1傳代培養(yǎng)方法第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.5.2傳代培養(yǎng)過程分析生長過程經(jīng)歷：潛伏期、指數(shù)生長期、減速期、平臺期、衰退期培養(yǎng)期間，每1~2天需要對細(xì)胞做常規(guī)檢查，包括：是否污染、細(xì)胞生長狀況、培養(yǎng)液PH傳代培養(yǎng)過程分析包括細(xì)胞形態(tài)檢查及活力分析與營養(yǎng)液PH及污染檢查。第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞形態(tài)檢查Δ將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察。

Δ狀態(tài)良好的細(xì)胞：輪廓形態(tài)不十分清晰，較透明。

Δ生長不良的細(xì)胞：輪廓變清晰，細(xì)胞間隙增大，胞內(nèi)有空泡、脂滴、顆粒等。細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三

細(xì)胞活力分析MTT法簡單、快速、準(zhǔn)確、廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性試驗(yàn)等方面采用MTT法?；罴?xì)胞的線粒體脫氧氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲暨并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含甲暨量成正比。用酶標(biāo)儀測定OD570nm值就可以分析活細(xì)胞數(shù)量。第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三營養(yǎng)液PH及污染檢查含血清的新鮮培養(yǎng)液呈桃紅色，PH在7.2~7.4之間。一段時間后，CO2的積累使培養(yǎng)液PH下降，當(dāng)超出緩沖范圍時，培養(yǎng)液變黃，需要3~4d更換一次培養(yǎng)液。CO2培養(yǎng)箱能自動控制5%的CO2含量。易出現(xiàn)微生物污染。細(xì)菌污染時培養(yǎng)液變渾濁，鏡檢可見。PPLO因個體小，能透過濾器，污染時培養(yǎng)物無變化，不易發(fā)現(xiàn)。嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。培養(yǎng)瓶口蓋需擰松或用無菌紗布棉塞以保證透氣。第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.6細(xì)胞系與細(xì)胞株細(xì)胞系：由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的能在體外生存的細(xì)胞群體。有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系一個報(bào)道的細(xì)胞株應(yīng)包括：培養(yǎng)簡歷、凍存液、細(xì)胞活力、培養(yǎng)液、細(xì)胞形態(tài)類型、核型、無污染檢測、物種檢測、免疫檢測、細(xì)胞建立者細(xì)胞株：從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.6.1分離純化與保存體外原代培養(yǎng)一般都是多種類型的細(xì)胞混合生長，必須經(jīng)過細(xì)胞純化得到單一種類細(xì)胞進(jìn)行功能、形態(tài)等研究1、自然純化：無法根據(jù)實(shí)際需求選擇細(xì)胞，費(fèi)時費(fèi)力2、人工純化細(xì)胞因子依賴法反復(fù)貼壁法酶消化法機(jī)械法3、克隆化培養(yǎng)毛細(xì)管法有限稀釋法細(xì)胞保存多采用凍存、低溫液氮凍存第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.6.2適合工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞株1、原代細(xì)胞：2、二倍體細(xì)胞：需要大量動物組織、成本高、費(fèi)時費(fèi)力二倍體染色體，具有貼壁和接觸抑制特性，有限的繁殖能力，無致瘤性具有兩親本特征4、基因工程細(xì)胞：3、融合細(xì)胞：將編碼藥用蛋白質(zhì)的基因重組到動物細(xì)胞構(gòu)建工程菌5、轉(zhuǎn)化細(xì)胞：體外可無限傳代和生長繁殖，遺傳、生長、生物學(xué)特性可能改變從生產(chǎn)方式上可分為細(xì)胞自轉(zhuǎn)化和人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化6、常用細(xì)胞株：CHO細(xì)胞VerocellBHK-21細(xì)胞WⅠ-38細(xì)胞第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.7動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)TextTextText細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)是指在生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)近幾十年，人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細(xì)胞介素等生物制品的需求不斷增加，傳統(tǒng)方法已不能滿足這一需求。因此，迫切需要建立動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。自20世紀(jì)70年代以來，細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器有了很大的進(jìn)展，推動了動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。目前貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶（管）、微載體系統(tǒng)、中空纖維、玻璃珠等。第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.7.1轉(zhuǎn)瓶（管）培養(yǎng)系統(tǒng)welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段采用專門設(shè)計(jì)的細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶機(jī)和不同規(guī)格的轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行培養(yǎng)有專門設(shè)計(jì)的旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)和不同規(guī)格的旋轉(zhuǎn)管在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的基礎(chǔ)上為擴(kuò)大培養(yǎng)而改進(jìn)的第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單、投資少、技術(shù)成熟、重復(fù)性好、放大只需簡單地增加轉(zhuǎn)瓶（管）數(shù)量缺點(diǎn)：勞動程度大、占地空間大、單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小、細(xì)胞生長密度低、培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受限第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.7.2微載體培養(yǎng)welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience1967年，維爾茨（vanWezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)。微載體系統(tǒng)將傳統(tǒng)的一維平面貼附擴(kuò)展為三維立體貼附，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）的限制。同時，微載體使利用生物反應(yīng)器進(jìn)行動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能滿足動物細(xì)胞的貼壁要求，又能充分利用生物反應(yīng)器的內(nèi)部空間。第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三微載體使直徑60~250μm的適用

于貼壁依賴型細(xì)胞生長的微珠理想的微載體應(yīng)具備以下幾個特征：良好的生物相容性，無毒無害有好的黏附性，一般帶正電荷大的比表面積，顆粒均勻，孔徑均一良好的傳質(zhì)性能強(qiáng)的機(jī)械性能，長時間攪拌狀態(tài)下不破碎，能保護(hù)細(xì)胞，方便清洗處理，重復(fù)利用好的熱穩(wěn)定性，在121℃蒸汽滅菌條件下不分解、不破碎、不軟化，適合高壓滅菌第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三微載體的分類實(shí)心微載體多孔微載體概念細(xì)胞能貼附在微載體表面生長內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，細(xì)胞能在微載體內(nèi)部生長優(yōu)點(diǎn)易于細(xì)胞在表面貼壁，機(jī)械強(qiáng)度高，容易接種操作比表面積更大，使細(xì)胞免受機(jī)械損傷，得到的細(xì)胞濃度高，可降低血清用量，可以采用高的攪拌速度和通氣量缺點(diǎn)細(xì)胞濃度低，細(xì)胞容易受剪切力、攪拌、碰撞等影響，細(xì)胞易老化脫落容易產(chǎn)生營養(yǎng)傳遞障礙，積聚代謝副產(chǎn)物第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三微載體的制作方法制作方法包括：高溫?zé)Y(jié)法、聚合物快速凝聚法、高分子材料成球聚合法、銳孔噴冷凍凝固法第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三微載體培養(yǎng)基本流程1、選擇合適的微載體類型：2、浸泡水化及消毒：3、接種：4、培養(yǎng)觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù)：5、傳代培養(yǎng)：6、細(xì)胞消化與收獲：第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三微載體培養(yǎng)應(yīng)注意的一些問題貼附率問題

細(xì)胞損傷問題攪拌問題傳代問題微載體質(zhì)量與成本問題第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)模擬了體內(nèi)三維生長環(huán)境，減輕了接觸性抑制，細(xì)胞可以多層生長表面積/體積（S/V）大，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)培養(yǎng)液可以循環(huán)使用，利用率高放大容易，勞動度小細(xì)胞接種、收獲簡便生物反應(yīng)器空間利用率高，培養(yǎng)系統(tǒng)節(jié)省空間第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.7.3中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience中空纖維生物反應(yīng)器（hollowfiberbioreactor）是理查德·克瑞克（RichardKncazek）等在1972年發(fā)明的。最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性膜，表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣，水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過，細(xì)胞也能在上面貼附生長。柱狀中空纖維反應(yīng)器、板框式中空纖維反應(yīng)器、中心灌流式反應(yīng)器第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三柱狀中空纖維反應(yīng)器第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三板框式中空纖維反應(yīng)器第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三中心灌流式反應(yīng)器第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.7.4大規(guī)模培養(yǎng)方式動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常采用的是：流加式培養(yǎng)和灌流式培養(yǎng)第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三流加式培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)可使細(xì)胞持續(xù)生長至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)物達(dá)到較高的水平。整個培養(yǎng)過程沒有培養(yǎng)液流出或細(xì)胞回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后終止培養(yǎng)。流加原則是維持細(xì)胞生長相對穩(wěn)定的營養(yǎng)條件，營養(yǎng)成分不過剩不缺乏通常流加時間在指數(shù)生長期后，一次或多次對消耗快或濃度過高對細(xì)胞不利的成分注意及時和少量多次不加流加的營養(yǎng)成分主要有葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、維生素等第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三

灌流式培養(yǎng)連續(xù)不斷的灌注新的培養(yǎng)液，同時不斷地排出舊培養(yǎng)液，細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)方式。優(yōu)點(diǎn)：（1）細(xì)胞截流在反應(yīng)器內(nèi)，可以維持較高的細(xì)胞密度，從而提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量（2）反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高（3）細(xì)胞穩(wěn)定地處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，可以去除氨、乳酸、甲基乙二醛等有害代謝物質(zhì)，減少細(xì)胞凋亡（4）可連續(xù)性收獲產(chǎn)品不足：污染概率較高，在長期培養(yǎng)中細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性差，規(guī)模放大過程中出現(xiàn)一些工程問題第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.7.5動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的問題分析第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三1、細(xì)胞代謝及產(chǎn)物抑制細(xì)胞培養(yǎng)過程中有害代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制是提高細(xì)胞密度的主要限制因素氨：抑制細(xì)胞生長的主要因素之一。來源于Gln的自然分解和細(xì)胞代謝所產(chǎn)生。乳酸：螯合鈣離子，抑制谷氨酰胺酶，↑滲透壓，↓PH，抑制細(xì)胞生長CO2：↓PH，對cell產(chǎn)生毒性作用或改變cell代謝甲基乙二醛：有潛在的損傷作用第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三2、培養(yǎng)基是cell賴以生長、增殖、分化的重要因素在經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基成為一種趨勢無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免了血清的批次、質(zhì)量、成分等對cell培養(yǎng)造成的不確定因素及污染、毒性作用和不利于產(chǎn)品純化等不良影響無血清培養(yǎng)基并不適用于廣泛的細(xì)胞類型，不同類型的細(xì)胞或不同的細(xì)胞系或細(xì)胞株都有可能有各自的無血清培養(yǎng)基組成在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段，細(xì)胞對于網(wǎng)速血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性往往具有特異性第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三3、細(xì)胞凋亡預(yù)防并控制細(xì)胞凋亡成為動物大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵之一細(xì)胞凋亡倒置死亡多是在營養(yǎng)成分耗盡、有害代謝產(chǎn)物增多時發(fā)生。谷氨酰胺的耗竭是常見的凋亡原因，凋亡一旦發(fā)生，不加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)動物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易凋亡可采用灌流式培養(yǎng)補(bǔ)充營養(yǎng)物，帶走有害代謝產(chǎn)物來減緩細(xì)胞凋亡?？刹捎没蚬こ谭椒▽cl-2基因（細(xì)胞凋亡抑制基因）導(dǎo)入細(xì)胞抑制細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞特定營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三4、過程監(jiān)控在線測定生物反應(yīng)器中培養(yǎng)條件、代謝及目的產(chǎn)物濃度等數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析處理，及時進(jìn)行反饋性控制是成功進(jìn)行大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。滲透壓：甘氨酸甜菜堿、三甲基甘氨酸或脯氨酸等滲透壓保護(hù)劑在一定程度上能減輕高滲透壓對細(xì)胞生長的抑制作用微載體：足夠的空間讓細(xì)胞生長，提高貼附率5、其他第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.8動物細(xì)胞生物制藥高等哺乳動物細(xì)胞可以很好表達(dá)修飾大分子的具有生物活性的蛋白產(chǎn)品一批被FDA批準(zhǔn)的動物細(xì)胞制備的藥物：胰島素、組織纖溶酶原激活劑、促進(jìn)細(xì)胞生成素、白介素等動物細(xì)胞生物制藥已經(jīng)成為疫苗、基因工程藥物、抗體藥物、蛋白藥物等生物制品生產(chǎn)的重要技術(shù)第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.8.1病毒疫苗減毒活疫苗：基因缺失的減毒活疫苗：滅活疫苗：亞單位疫苗：流感病毒的包膜提取后制成的血凝素、神經(jīng)氨酸酶亞單位疫苗麻疹疫苗、風(fēng)疹疫苗、黃熱病疫苗、狂犬病毒的胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3區(qū)缺失株（第二代）流行性乙型腦炎疫苗、狂犬病疫苗、流感滅活疫苗基因工程亞單位疫苗：乙型肝炎病毒的表面抗原HBsAg的基因在酵母CHO細(xì)胞中表達(dá)的純品HBsAg多肽第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三病毒疫苗生產(chǎn)需要注意的一些問題培養(yǎng)病毒的細(xì)胞若有潛在的致癌性以及有支原體污染均不能用于疫苗生產(chǎn)。選擇病毒時，致病性低、免疫效價(jià)高而持久、抗原譜廣、易增殖、便于生產(chǎn)、可在傳代細(xì)胞上增殖的病毒應(yīng)盡量使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，消除含血清培養(yǎng)基帶來的過敏原。甲醛可去除病毒活性，保持其抗原性。但甲醛能引起疼痛和紅腫，并釋放組織胺，應(yīng)減少甲醛濃度也要保證病毒活性消失第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三11.8.2干擾素干擾素是一種細(xì)胞因子，是真核細(xì)胞對各種刺激反應(yīng)后形成的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)。1957年，英國的Issacs和瑞士Linderman在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)病毒感染的細(xì)胞能產(chǎn)生一種因子，可干擾病毒的復(fù)制，將其命名為干擾素。第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三干擾素的生理作用廣譜的抗病毒作用抑制某些細(xì)胞的生長免疫調(diào)節(jié)作用抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期三人白細(xì)胞干擾素IFN-α目前的人白細(xì)胞干擾素主要是基因工程干擾素基因工程α干擾素與血源性干擾素相比，具有沒有污染、安全性高、純度高、比活性高、成本低、療效確切等優(yōu)點(diǎn)從人細(xì)胞中克隆出α干擾素基因，與大腸桿菌表達(dá)載體連接構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中獲得高效表達(dá)人α干擾素蛋白的工程菌。發(fā)酵后收集大量菌體，裂解，分離純