DNA計(jì)算中熒光技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展公司內(nèi)部編號(hào)：(GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-張成楊靜王淑棟(北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，高可信度軟件技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京)摘要：DNA計(jì)算作為前沿科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，已經(jīng)從簡單發(fā)展為復(fù)雜，從理論轉(zhuǎn)化為應(yīng)用。在這一過程中，反應(yīng)速度快，變化靈敏的熒光標(biāo)記技術(shù)發(fā)揮了重要的作用。本文圍繞DNA計(jì)算和熒光標(biāo)記技術(shù)兩個(gè)方面進(jìn)行說明。一方面，對(duì)近年來DNA計(jì)算中熒光技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)：(1)熒光標(biāo)記的表面計(jì)算。(2)與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測(cè)。(3)與DNA鏈置換相結(jié)合的熒光技術(shù)。 (4)與基因沉默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門。(5)與DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)。(6)與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)。另一方面，介紹了幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術(shù)：(1)熒光信號(hào)識(shí)別放大技術(shù)。(2)與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)。(3)與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)。(4)與1引言DNA由于其具有的特性，在大自然的進(jìn)化中，被選擇為穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)。在易構(gòu)成二級(jí)甚至三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，DNA作為計(jì)算工具有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)1,2。近然而伴隨著DNA計(jì)算解決問題的規(guī)模增大和形式多樣化，求解過程中DNA分子數(shù)量急劇增加以及DNA分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的加大，求解過程中實(shí)驗(yàn)過程繁瑣且存在誤技術(shù)在DNA計(jì)算中逐漸得到了廣泛的應(yīng)用。熒光是指某些物質(zhì)受到某種波長的光激發(fā)后，其原子中的電子被激發(fā)到較高能級(jí)，產(chǎn)生的發(fā)射光。熒光物質(zhì)分子都具以持續(xù)數(shù)秒鐘，從而有利于能量的轉(zhuǎn)移5。DNA熒光技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)有很術(shù)等。熒光標(biāo)記DNA簡單便捷，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)，而且靈敏度非常高，這些特點(diǎn)都算中的應(yīng)用主要有如下幾類：(1)熒光標(biāo)記的表面計(jì)算：通過DNA固定化和雜交技術(shù)，在固相表面通過熒光標(biāo)記進(jìn)行計(jì)算。(2)與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒 (3)與DNA鏈置換相結(jié)合的熒光技術(shù)：巧妙利用DNA分子的三鏈甚至多鏈結(jié)態(tài)，構(gòu)建了可控的熒光納米裝置。近年來，熒光技術(shù)不僅應(yīng)用于生物學(xué)本身，而且在DNA計(jì)算、信息學(xué)等諸多領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。下面有幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術(shù)：(1)熒光信號(hào)識(shí)別放大技術(shù)。(2)與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)。(3)與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)。(4)與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光技術(shù)。相信隨著DNA計(jì)算和熒光技術(shù)的發(fā)展，這兩者必將緊密結(jié)合，使得DNA計(jì)算的種類和方法更加多樣和成熟。2DNA計(jì)算中熒光技術(shù)的應(yīng)用熒光標(biāo)記的表面計(jì)算DNA表面計(jì)算其基本原理是：通過DNA固定化和雜交技術(shù)，將代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通過多次的雜交以及降解過程來篩選雜交池完成了一個(gè)20個(gè)變量的3可滿足性問題6。2004年XingPingSu等在2000年Liu7的工作基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種通用型的DNA表面計(jì)算模型8。同年，KristianeA.Schmidt等利用單分子雜交熒光標(biāo)記技術(shù)4個(gè)變量的可滿足性問題9。特異性互補(bǔ)的DNA。那末，被雜交的固定DNA鏈變?yōu)殡p鏈，而未互補(bǔ)的單鏈DNA則被核酸外切酶Ⅰ降解。通過數(shù)次操作，存在于固相表面的DNA鏈就是每次經(jīng)雜交而保留下來的DNA鏈，也就是代表正解的DNA鏈。該實(shí)驗(yàn)中，熒光技術(shù)主要應(yīng)用在解檢測(cè)的過程中：使用一條生物素標(biāo)記的引物和另一條熒光標(biāo)記的引物，以附，再分離雙鏈，分離出熒光標(biāo)記的ssDNA。將這些ssDNA與經(jīng)過多次雜交篩選的固相雜交，只有哪些存留在固相表面的DNA鏈可以雜交上，于是特定的位置就可以檢測(cè)到較高熒光強(qiáng)度。圖1-1實(shí)驗(yàn)示意圖圖1-2列陣熒光檢測(cè)結(jié)果與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測(cè)利用酶與DNA分子的特性，通過檢測(cè)酶切后熒光量進(jìn)行計(jì)算。其實(shí)就是利用某些酶與DNA分子空間結(jié)構(gòu)的相互作用，再結(jié)合熒光技術(shù)來共同實(shí)現(xiàn)的。這種方法具有靈敏度高，反應(yīng)速度快等特點(diǎn)。其最大的優(yōu)點(diǎn)就是巧妙地將酶的生物特性進(jìn)，即將酶切和熒光技術(shù)相結(jié)合10。通過上述核酸外切酶的方法，利用新技術(shù)完側(cè)探針由兩部分組成：一部分是和目標(biāo)序列形成雙鏈的；另一部分則是由非互補(bǔ)核苷酸鏈上，與左側(cè)探針至少有一個(gè)重合的堿基。恰恰在這重合的位置，可以形利用這一原理，結(jié)合熒光技術(shù)，如圖所示，將熒光基標(biāo)記在非互補(bǔ)DNA鏈的5’端，而將熒光淬滅基標(biāo)記在重合的酶切位點(diǎn)3’端方向(見圖2B)。這樣，與熒光淬滅基分離，使得熒光釋放量大大提高。這種方法可以有效檢測(cè)目的片斷是否存在。文中還將PCR方法檢測(cè)目的片斷與這種熒光檢測(cè)法進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)圖2實(shí)驗(yàn)原理示意圖圖3幾種邏輯門的構(gòu)成示意圖MilanN.等2003年研制了一種名為MAYA的游戲。這是一種利用特殊的DNA酶E6(一種依賴于DNA的RNA酶)構(gòu)建起來的邏輯門11。這種酶識(shí)別的DNA底物要求具有特殊結(jié)構(gòu)(如3a圖所示)。只有當(dāng)上部寡核苷酸探針與E6的支架區(qū)互補(bǔ)，上部寡核苷酸才能被切斷釋放。將寡核苷酸兩端分別標(biāo)記熒光淬滅基(如羅丹明)和熒光基，那末只有寡核苷酸探針被切斷釋放，熒光基才能有效激活并釋放熒光。這是MAYA游戲進(jìn)行邏輯判斷的主要檢測(cè)手段。構(gòu)建有效的空間位阻是實(shí)現(xiàn)這個(gè)檢測(cè)手段的關(guān)鍵。當(dāng)寡核苷酸探針的結(jié)合使綠色標(biāo)記的位阻消失的時(shí)候，加速酶切反應(yīng)；當(dāng)寡核苷酸探針的結(jié)合使紅色標(biāo)記的位阻消失的時(shí)候，降低酶切反應(yīng)。AND-NOT型。YES型邏輯門(圖3b所示)，當(dāng)i1寡核苷酸加入時(shí)，消除原來i1過稱為加入i1，熒光輸出。NOT型邏輯門(圖c所示)。當(dāng)加入i6時(shí)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，熒光結(jié)合的寡核苷酸探針無法結(jié)合在互補(bǔ)區(qū)域，于是無熒光輸出。其判斷過程為加入i6，熒光輸出停止。AND型邏輯門(圖d所示)實(shí)際上是將兩個(gè)YES型AND-AND-NOT型邏輯門(圖e)是更為復(fù)雜的組合體。必須同時(shí)加入i1和i3，才3×3的棋盤中完成3個(gè)棋子同線相連?？疾焖械倪壿嬊闆r后，將所有可能的邏輯門都提前置于棋盤的網(wǎng)格中。再將代表棋子的寡核苷酸分別放入，然后觀察熒光輸出情況進(jìn)行判斷。該技術(shù)多用來構(gòu)建DNA邏輯門。其巧妙利用DNA分子的粘貼，通過加入引發(fā)鏈，來釋放另一DNA鏈。在邏輯計(jì)算中，這種技術(shù)具有循環(huán)性、自引發(fā)性、反饋性、靈敏性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。近年來在science等高水平科研雜志上都發(fā)表了大Yurke構(gòu)建了一種DNA鏈置換機(jī)器，在置換過程中可以實(shí)現(xiàn)閉合式運(yùn)動(dòng)12。2003年，B.Yurke等構(gòu)建了一種基于DNA鏈置換的納米機(jī)器13。Jong-ShikShin等利用可反復(fù)的DNA鏈置換，構(gòu)建了可以反復(fù)讀取和輸入的三狀態(tài)存儲(chǔ)器14。2006年，GeorgSeelig等對(duì)DNA鏈相互粘貼、置換的幾種模式進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)15。2006年，SimonJ.Green等用莖環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了DNA鏈的粘貼互換16。2007年，DavidYuZhang等實(shí)現(xiàn)了DNA鏈置換的循環(huán)進(jìn)行17。2007年,suvirvenkataraman等實(shí)現(xiàn)了通過DNA鏈自粘貼來完成多段DNA聚合延伸18。下面介紹兩個(gè)具有代表性的工作。原理如圖4-1所示，即先構(gòu)建好由寡核苷酸鏈G、E、F共同雜交組成的DNA互out補(bǔ)結(jié)構(gòu)，再加入G寡核苷酸鏈。此時(shí)，由于G一側(cè)末端和G的一側(cè)單鏈末端互inin補(bǔ)，從而使邏輯門中的G寡核苷酸鏈被釋放，與G形成互補(bǔ)雙鏈。此時(shí)的互補(bǔ)端與F中間有互補(bǔ)序列，加之E本身形成的是單鏈環(huán)狀的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，于是，F(xiàn)out和F結(jié)合成雙鏈。E寡核苷酸鏈被釋放。文中使用了熒光標(biāo)記地對(duì)E的釋放inoutoutqf淬滅基。當(dāng)其互補(bǔ)結(jié)構(gòu)存在時(shí)，熒光恰被淬滅，從而無法檢測(cè)。但是，當(dāng)E和Fqf分離時(shí)，熒光就被釋放出來，從而表明DNA鏈的分離情況。上述由G、E、F的outDNA互補(bǔ)結(jié)構(gòu)就可以構(gòu)成與門。也就是說，只有同時(shí)加入G和F，才能誘發(fā)釋inin放出熒光。值得注意的是，文章并不只是提出這種DNA計(jì)算邏輯門，而是將其應(yīng)用到生物基因檢測(cè)的中。在鼠腦總RNA中，成功的檢測(cè)了數(shù)個(gè)基因的表達(dá)情況。示Aa、b、bt、ct、c等DNA序列構(gòu)成的，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)末端有未互補(bǔ)的單鏈DNA區(qū)域。如果加入與末端單鏈DNA互補(bǔ)的序列，整個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)就會(huì)打開(圖中的at與at*可以互補(bǔ)，其它同理)。因此，當(dāng)體系中只加入A、B這兩種莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，相互之間無任何影響。但是，當(dāng)體系中加入了寡核苷酸鏈I后，就觸發(fā)了整個(gè)循區(qū)域形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。被置換掉的I就可以重新激發(fā)新的循環(huán)。在上述基礎(chǔ)之上，PengYin等設(shè)計(jì)了多種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)：直線型、回路型、支架型、自動(dòng)位移型(見圖5-2)。直線型指I與A、B、C組件是逐級(jí)觸發(fā)，形成串聯(lián)關(guān)系?；芈沸椭竻⑴c的激發(fā)物在循環(huán)結(jié)束后又被釋放，從而再次作用于系統(tǒng)。并且構(gòu)建了多個(gè)循環(huán)相互鑲嵌的復(fù)雜體系。支架型指在整個(gè)觸發(fā)過程中，不僅是線性的作用方向，而且是向二維平面的擴(kuò)展。自動(dòng)位異型則是用鏈置換實(shí)現(xiàn)了特定DNA序列的位移。在這些實(shí)驗(yàn)中，熒光技術(shù)發(fā)揮了重要的作用。其中主要是將熒光基標(biāo)記在莖環(huán)的一端，另一端則標(biāo)記有熒光淬滅基。只有莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，才能夠檢測(cè)到相應(yīng)的熒光。根據(jù)標(biāo)記不同的熒光，可以了解整個(gè)循環(huán)的反應(yīng)速度，和反應(yīng)程度。尤其是在自動(dòng)位移型實(shí)驗(yàn)中，通過檢測(cè)熒光，可以得知回型直線型支架型圖5-2幾種復(fù)雜類型：直線型、回路型、支架型、自動(dòng)位移型默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門基因的表達(dá)，構(gòu)建多重邏輯門。這種技術(shù)將DNA計(jì)算和基因表達(dá)、疾病診療有機(jī)RNAi技術(shù)是近年來發(fā)展起來的特異性沉默基因技術(shù)，其基本原理就是將想敲除的基因序列或者部分序列構(gòu)建到特定載體中，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，形成部分序列的反義RNA(還可以通過直接加入特異的反義短寡核苷酸進(jìn)行基因敲除)。這些RNA很快就可以被酶解為小片段，并與相關(guān)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。于是，這種復(fù)合體就可以根據(jù)RNA來識(shí)別特定的mRNA，從轉(zhuǎn)錄水平消除特定基因。keller等利用載體序列的線形串聯(lián)排列以及基因表達(dá)的調(diào)控原理(非翻譯區(qū)TRa所示，mRNA1和mRNA2分別與熒光蛋白基因串聯(lián)。這兩個(gè)mRNA只要有一個(gè)正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，就會(huì)有熒光蛋白輸出。因此，形成了“或”的關(guān)系。(2)與門，如圖tBAB成“與”的關(guān)系。(3)非門，如圖6-1c所示，假設(shè)內(nèi)源物A對(duì)siRNA-NOT(A)有激活作用。當(dāng)加入A后，將會(huì)抑制Target-NOT(A)的表達(dá)，此時(shí)直接導(dǎo)致熒光蛋白產(chǎn)物的減少。將這些簡單的邏輯門組合起來，就可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的邏輯運(yùn)算，如(AANDCANDE)OR(NOT(A)ANDB)，見圖6-1d。首先確定A、 (A)。當(dāng)A、B、C、E共同作用時(shí)，就可以根據(jù)基因排列的線性關(guān)系自動(dòng)進(jìn)行邏在上述一步完成的RNAi邏輯門的基礎(chǔ)上，還構(gòu)建了二層邏輯門。所謂一步首先調(diào)控一級(jí)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，再由一級(jí)蛋白質(zhì)來調(diào)控二級(jí)熒光蛋白基因的表達(dá)。如種多層邏輯門與細(xì)胞內(nèi)的蛋白、基因調(diào)控極為相似，因此在疾病診療方面有著廣闊的應(yīng)用前景。DNA的熒光技術(shù)DNA自組裝是近期發(fā)展迅速的領(lǐng)域，也是具有應(yīng)用前景的領(lǐng)域。其涉及編碼、雜交、空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)等多個(gè)方面。從自組裝結(jié)構(gòu)上分，自組裝可分為一維線段結(jié)構(gòu)、二維平面結(jié)構(gòu)和三維立體結(jié)構(gòu)。在DNA自組裝結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，發(fā)展了很多精巧的DNA三維結(jié)構(gòu)，如2008年RussellPGoodman等構(gòu)建的四面體，其邊還可以產(chǎn)生熒光標(biāo)記的可伸縮莖環(huán)22。這些三維結(jié)構(gòu)不僅僅包含有圖像、結(jié)構(gòu)信息，而且還能隨著結(jié)構(gòu)的變化應(yīng)用于納米技術(shù)、藥物載體、DNA2008年YossiWeizmann等的工作是將DNA自組裝和熒光技術(shù)緊密結(jié)合的一能夠看到環(huán)鏈結(jié)構(gòu)的存在。另外，將一個(gè)環(huán)狀寡核苷酸固定在有金包被的AFM電鏡感應(yīng)頭上，而與其有互補(bǔ)序列的寡核苷酸則被固定在鍍有金的玻璃板上。當(dāng)雜交并且被連接后，其感應(yīng)力較未被連接有了顯著提高，側(cè)面說明環(huán)套結(jié)構(gòu)的存在。在此基礎(chǔ)上，還設(shè)計(jì)了將DNA環(huán)分別固定在兩個(gè)金微粒()上，然后利用內(nèi)切酶進(jìn)行切割分離的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，這些操作都可以在環(huán)套結(jié)構(gòu)上成功實(shí)除了上述電鏡檢測(cè)外，YossiWeizmann等還利用熒光技術(shù)進(jìn)行了一系列實(shí)環(huán)套和多個(gè)短寡核苷酸復(fù)合物。在電鏡下，可以觀察到柱狀熒光條帶。然后，使用四甲基羅丹明標(biāo)記的凝血酶，當(dāng)凝血酶結(jié)合在環(huán)套的側(cè)面時(shí)，利用AFM電鏡就可以觀察到熒光條狀DNA，并伴有多節(jié)膨大結(jié)構(gòu)。同時(shí)，還對(duì)環(huán)套結(jié)構(gòu)進(jìn)行了類似的雙熒光探針雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。因?yàn)橹挥挟?dāng)兩個(gè)熒光基和淬滅基的距離小于5nm時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移，因此，也說明環(huán)套結(jié)構(gòu)是有DNA示意圖2009年EbbeS.Andersen等巧妙地將DNA熒光技術(shù)應(yīng)用在檢測(cè)納米裝置開啟和閉合24。為了檢測(cè)DNA分子納米盒子的蓋子的開閉，分別在蓋子和盒體上標(biāo)記了Cy3和Cy5熒光染料(見圖7-3)。當(dāng)加入“鑰匙”DNA鏈時(shí)，盒子蓋打開，兩個(gè)熒光分子分開。此時(shí)，Cy3的熒光信號(hào)增加，而Cy5熒光信號(hào)下降。在該實(shí)驗(yàn)中，利用熒光信號(hào)增減可以有效地檢測(cè)DNA納米裝置的空間變化。記的序列，其中含有多個(gè)GC的重復(fù)序列。當(dāng)改變離子濃度時(shí)，該區(qū)域就會(huì)伸展成為左旋結(jié)構(gòu)。將熒光發(fā)射基和接收基固定在如下所示位置(圓點(diǎn))。那末只有其能量轉(zhuǎn)移3近期熒光技術(shù)的新發(fā)展熒光技術(shù)發(fā)展速度很快，在DNA計(jì)算、信息學(xué)、物理學(xué)等諸多領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。下面介紹幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術(shù)，希望能為DNA計(jì)算提供新的思路。(1)熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)；(2)與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)(3)與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)；(4)與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)分子信標(biāo)技術(shù)是目前較為成熟的技術(shù)，尤其是在檢測(cè)方面有著重要的應(yīng)用。但是當(dāng)檢測(cè)物很少時(shí)，分子信標(biāo)產(chǎn)生的熒光就不足以被檢測(cè)，甚至發(fā)生錯(cuò)誤信Lewis等設(shè)計(jì)了能同時(shí)激發(fā)多種熒光的方法，使得DNA檢測(cè)速度以及準(zhǔn)確度都大大提高27。2008，JianweiJefferyLi等提高了熒光分子信標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度28。其原理(如圖9-1所示)就是先通過普通的分子信標(biāo)雜交過程，待分子雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)后，此時(shí)，加入特異的缺刻DNA酶，即將因雜交而展開的分子信標(biāo)切斷，并釋熒光信號(hào)就會(huì)積累增多。在此基礎(chǔ)上，還建立了一種加強(qiáng)型熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)(如圖9-2所示)。首先，與目標(biāo)片斷互補(bǔ)的DNA為模板，加入單引物進(jìn)行PCR。在隨后擴(kuò)增的線性模板上，就含有多處目標(biāo)片斷。此時(shí)，再進(jìn)行上述的熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大。就可以大大提高信號(hào)強(qiáng)度。圖9-1熒光信號(hào)積累原理圖9-2加強(qiáng)型熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大原理DNA測(cè)熒光技術(shù)DNA1、2、3相互雜交，形成復(fù)合體。在DNA3上標(biāo)記有熒光集團(tuán)。通過磁珠分與帶有正電荷的水溶性聚乙烯(被標(biāo)記有特殊基團(tuán))吸附。此時(shí)就會(huì)產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生熒光，并被檢測(cè)(如圖10所示)。A列構(gòu)成的。在每個(gè)寡核苷酸的5’端標(biāo)記有-SH，隨后是由-CCCC-4個(gè)胞嘧啶組成金表面。當(dāng)PH值較低時(shí)(4-9之間)，有些胞嘧啶會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，從而與其他胞嘧啶產(chǎn)生分子間非經(jīng)典配對(duì)。此時(shí)，寡核苷酸鏈就會(huì)形成蜷縮狀結(jié)構(gòu)，而不會(huì)與互補(bǔ)鏈雜交(如圖11-1所示)。在這種狀態(tài)下，熒光集團(tuán)非?？拷鸨砻?約1nm)，此時(shí)就不能被激發(fā)光激發(fā)。隨著PH值的增大，胞嘧啶質(zhì)子化程度降低，其分子間非經(jīng)典配對(duì)也隨之降低。若加入互補(bǔ)鏈，在金表面，展開的寡核苷酸會(huì)與互補(bǔ)鏈雜交，使得寡核苷酸3’端的熒光集團(tuán)遠(yuǎn)離金表面(約8nm)。當(dāng)有激發(fā)光激發(fā)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生綠色熒光，實(shí)驗(yàn)還證實(shí)這種熒光的變化是可逆的。通過控miRNAs在真核生物的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。但是miRNAs的含量很低，檢測(cè)起來比較困難。結(jié)合DNA寡核苷酸微列陣技術(shù)、熒光技術(shù)、酶切、酶聯(lián)技術(shù)，2004年P(guān)eterTNelson等發(fā)明了一種稱為RAKE的檢測(cè)miRNAs的方法31。首先建立寡核苷酸微列陣。每個(gè)寡核苷酸由三部分組成：支架序列、數(shù)個(gè)胸腺嘧啶、特異性miRNAs的互補(bǔ)序列。將寡核苷酸鏈5’端共價(jià)連在芯片玻璃表面。其次，當(dāng)AsmiRNAs的寡核苷酸鏈降解。此時(shí)保留下來的寡核苷酸上都雜交有miRNAs。與此同時(shí)，使用DNA聚合酶Klenow，以miRNAs為引物，以保留下來的寡核苷酸鏈為模板，再加入共價(jià)連接有生物素的dATP進(jìn)行擴(kuò)增。最后，加入共價(jià)連接有熒光基團(tuán)的鏈合霉素，使其與連接有生物素的DNA鏈結(jié)合。通過激發(fā)熒光，保留下來的、并被擴(kuò)增了的寡核苷酸區(qū)域就會(huì)發(fā)出熒光。其熒光量的多少，還能顯示該miRNAs4展望在生物技術(shù)高速發(fā)展的今天，DNA計(jì)算的研究也是日新月異。近年來，在高界科研領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。DNA計(jì)算發(fā)展至今，已經(jīng)從開始的實(shí)驗(yàn)階段逐漸轉(zhuǎn)入實(shí)用階段；從單一型技術(shù)逐漸發(fā)展為多元化技術(shù)；從簡單的結(jié)構(gòu)逐漸擴(kuò)增為復(fù)雜結(jié)構(gòu)。熒光技術(shù)作為一種生物技術(shù)，其發(fā)展較早，且應(yīng)用廣泛。因其體積小，便于標(biāo)記，反應(yīng)速度快，變化靈敏，所以在核酸標(biāo)記和檢測(cè)方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于DNA計(jì)算這種精細(xì)化、定量化、復(fù)雜化的發(fā)展，熒光技術(shù)的種種特性都法實(shí)現(xiàn)。而熒光技術(shù)的單個(gè)分子標(biāo)記，熒光激發(fā)和湮滅性質(zhì)，及其實(shí)時(shí)超高靈敏性檢測(cè)都表明其在DNA計(jì)算中的天然優(yōu)勢(shì)。因此，熒光技術(shù)的進(jìn)步必然推動(dòng)DNA跨學(xué)科、跨領(lǐng)域的融合貫通是推動(dòng)整個(gè)科學(xué)前進(jìn)的原動(dòng)力。一方面，應(yīng)該關(guān)注熒光技術(shù)與其他生物技術(shù)(如基因芯片技術(shù)、磁珠技術(shù)等)最新的發(fā)展和聯(lián)系；另一方面，必須深刻的認(rèn)識(shí)和了解計(jì)算科學(xué)所亟需解決的重要問題。只有充分的將兩個(gè)方面有機(jī)地結(jié)合，通過提出創(chuàng)造性想法，才能將DNA計(jì)算轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)用、穩(wěn)定參考文獻(xiàn)1.許進(jìn)等.DNA計(jì)算機(jī)原理、進(jìn)展及難點(diǎn)(Ⅲ)分子生物計(jì)算中的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)與特性.2.HaoYan.NucleicAcidNanotechnology.Science,306,2048-20493.J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