RNA測序技術原理及應用現(xiàn)在是1頁\一共有53頁\編輯于星期日遺傳的中心法則基因組—轉錄組—表觀遺傳組—蛋白組層次現(xiàn)在是2頁\一共有53頁\編輯于星期日什么是轉錄組？All

transcripts

All

mRNAs現(xiàn)在是3頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA是解讀基因組的關鍵RNAProteinPhenotypeGenotype

DNA現(xiàn)在是4頁\一共有53頁\編輯于星期日測序技術RNA-SeqSmallRNA測序降解組測序Non-codingRNA測序研究對象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鑒定新分子OOOO表達譜研究OOOO基因結構分析O/XXXOEST測序O/XXXX

篩選分子標記

OOOX轉錄融合基因表達O/XXXXRNA測序技術現(xiàn)在是5頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析現(xiàn)在是6頁\一共有53頁\編輯于星期日TotalRNA樣品檢測

Agilent2200檢測OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷倫2200TapeStation

系統(tǒng)是新一代測序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質純化和抗體生產過程中對生物樣品進行質量控制（QC）的理想解決方案。●

可擴展的通量—16聯(lián)或96孔微量滴定板●

快速得到結果—平均每個樣品只需一分鐘便可獲得結果●

使用簡單—可直接使用的ScreenTape預制膠條簡化了工作流程●

樣品用量少—每次運行僅需要不到2ul樣品現(xiàn)在是7頁\一共有53頁\編輯于星期日檢測報告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅現(xiàn)在是8頁\一共有53頁\編輯于星期日檢測報告-不合格樣品現(xiàn)在是9頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析現(xiàn)在是10頁\一共有53頁\編輯于星期日真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素標記Oligo（dT）25+poly（A）現(xiàn)在是11頁\一共有53頁\編輯于星期日原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitLNA扣鎖型探針現(xiàn)在是12頁\一共有53頁\編輯于星期日mRNA反轉錄---fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀產物。RTdscDNA現(xiàn)在是13頁\一共有53頁\編輯于星期日末端修復(防止自連）cDNA3′末端加AAdapter連接現(xiàn)在是14頁\一共有53頁\編輯于星期日第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓文庫制備↓↓文庫質量檢測：Aligent2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測：跑膠驗證?，F(xiàn)在是15頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析現(xiàn)在是16頁\一共有53頁\編輯于星期日ApplicationRNA-Seq(單端測序---Quantification)RNA-Seq

(雙端測序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq17現(xiàn)在是17頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Transcriptome)現(xiàn)在是18頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息學分析現(xiàn)在是19頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)現(xiàn)在是20頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文庫構建測序組裝現(xiàn)在是21頁\一共有53頁\編輯于星期日Denovoassembleatranscriptome組裝流程現(xiàn)在是22頁\一共有53頁\編輯于星期日數(shù)據(jù)產出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質量評估組裝結果分析（Contig長度分布、Scaffold長度分布、Unigene長度分布）Unigene（transcript）功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預測編碼蛋白框（CDS）Unigene表達差異分析（兩個或兩個以上樣品）Unigene在樣品間的差異GO分類（需兩個或兩個以上樣品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要內容：現(xiàn)在是23頁\一共有53頁\編輯于星期日Denovoassemblytranscriptome信息分析流程現(xiàn)在是24頁\一共有53頁\編輯于星期日Unigenes的GO注釋現(xiàn)在是25頁\一共有53頁\編輯于星期日Pathway分析現(xiàn)在是26頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文庫構建測序比對到參考序列現(xiàn)在是27頁\一共有53頁\編輯于星期日Transcriptomeresequencing比對流程現(xiàn)在是28頁\一共有53頁\編輯于星期日比對統(tǒng)計基因表達注釋基因差異表達分析基因結構優(yōu)化可變剪接分析預測新轉錄本cSNP分析Transcriptomeresequencing信息分析主要內容現(xiàn)在是29頁\一共有53頁\編輯于星期日Transcriptomeresequencing信息分析流程現(xiàn)在是30頁\一共有53頁\編輯于星期日應用---優(yōu)化轉錄組注釋信息基因結構優(yōu)化可變剪接鑒定基因融合鑒定RNA水平SNP分析現(xiàn)在是31頁\一共有53頁\編輯于星期日GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistribution優(yōu)化基因結構

鑒定新的轉錄本Paired-End(PE)ReadsReads比對到參考序列基因間區(qū)域現(xiàn)在是32頁\一共有53頁\編輯于星期日鑒定可變剪接（AlternativeSplicing）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA現(xiàn)在是33頁\一共有53頁\編輯于星期日鑒定基因融合PairedReadsSingleReadsGeneAGeneB現(xiàn)在是34頁\一共有53頁\編輯于星期日分析RNA水平SNP轉錄組重測序比對軟件：SOAPDenovo轉錄組測序:組裝軟件：SoapDenovo比對軟件：SoapSNP現(xiàn)在是35頁\一共有53頁\編輯于星期日36轉錄組研究技術橫向比較TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes現(xiàn)在是36頁\一共有53頁\編輯于星期日轉錄組測序的優(yōu)勢RNA測序與芯片檢測基因數(shù)比較RNA測序與芯片檢測基因的表達量分布Technique1現(xiàn)在是37頁\一共有53頁\編輯于星期日GenomeRes2010Case

實驗材料收集：

葉片，花序,果實,根時間點：0,4,8,12,16,20和24h將每個時間點采集的樣品均勻混合測序策略：

Illumina測序，1Gdata現(xiàn)在是38頁\一共有53頁\編輯于星期日1.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相關可變剪接現(xiàn)在是39頁\一共有53頁\編輯于星期日外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低溫脅迫相關的AS低溫脅迫下這個內含子和對照相比被保留了下來，揭示了可變剪接有重要功能?，F(xiàn)在是40頁\一共有53頁\編輯于星期日AS調節(jié)機制CCA1生物鐘相關基因，例如調節(jié)氣孔的開關等現(xiàn)在是41頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq單端測序（Quantification）等同于數(shù)字表達譜(DGE)現(xiàn)在是42頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息學分析現(xiàn)在是43頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息分析內容測序數(shù)據(jù)評估篩選差異表達基因表達模式聚類分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作網(wǎng)絡分析現(xiàn)在是44頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq單端測序（Quantification）信息分析流程現(xiàn)在是45頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點比較技術優(yōu)點缺點RNA-seq1）檢測基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準，可重復性高（重復相關系數(shù)≥0.99）3）數(shù)字化信號，無背景噪音，無交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測6）數(shù)據(jù)可與時俱進，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊含的豐富信息基因芯片1）平臺應用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺要求樣品量少1）檢測靈敏度較低、重復性差、檢測閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽性率＞1%3）受物種限制，只能檢測部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度基因5）只能檢測已知轉錄本，無法檢測出新轉錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設計的，可能出現(xiàn)注釋不準確的情況現(xiàn)在是46頁\一共有53頁\編輯于星期日casePlantPhysiology2010取樣：

選取在成熟季節(jié)開花后