引物是一段特定的DNA序列，可以在退火溫度下和模版鏈特異性結(jié)合，引導(dǎo)PCR體系中的dNTP根據(jù)與模版鏈堿基配對(duì)原則延伸出一條新的鏈．引物的序列是根據(jù)要擴(kuò)增的DNA序列而設(shè)計(jì)的．第一頁(yè)，共55頁(yè)。

引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。第二頁(yè)，共55頁(yè)。一、引物設(shè)計(jì)基礎(chǔ)引物設(shè)計(jì)流程：1）序列查找下載；2）序列同源性比較；3）引物設(shè)計(jì)與篩選；4）加工修飾；5）評(píng)價(jià)分析；6）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)軟件第三頁(yè)，共55頁(yè)。引物的設(shè)計(jì)以及初步篩選引物的設(shè)計(jì)與初步篩選基本上通過(guò)一些分子生物學(xué)軟件和相關(guān)網(wǎng)站來(lái)完成的，目前運(yùn)用軟件primerpremier5或美國(guó)whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所基因組研究中心在因特網(wǎng)上提供的一款免費(fèi)在線PCR引物設(shè)計(jì)程序primer3來(lái)設(shè)計(jì)引物。第四頁(yè)，共55頁(yè)。引物設(shè)計(jì)操作流程

1.序列下載（序列查找根據(jù)所需檢測(cè)的病原體或者待檢特定基因，在網(wǎng)址查詢有關(guān)序列。）↓2.同源性比較（尋找保守序列設(shè)計(jì)引物）（在網(wǎng)址進(jìn)行在線的兩兩比較）↓3.引物設(shè)計(jì)篩選第五頁(yè)，共55頁(yè)。引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。第六頁(yè)，共55頁(yè)。引物設(shè)計(jì)基本原則①引物長(zhǎng)度。②堿基隨機(jī)分布的均衡性。③Tm值④引物二級(jí)結(jié)構(gòu)。⑤引物3端。⑥引物5端。⑦引物的內(nèi)部穩(wěn)定性。⑧自由能分布。第七頁(yè)，共55頁(yè)。1.引物長(zhǎng)度一般引物的長(zhǎng)度為15-30bp，常用的長(zhǎng)度為18-21bp。過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都不合適，為過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，引物過(guò)短會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的。例如：

一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3x109/412=200).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè).

較長(zhǎng)的引物（28-35bp)，一般是用來(lái)區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)。第八頁(yè)，共55頁(yè)。2.堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過(guò)5個(gè)GC含量一般40-60%，以45-55為宜。GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性，GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。第九頁(yè)，共55頁(yè)。3.引物Tm值一般要求：55℃-65℃。應(yīng)盡可能保證上下游引物Tm值一致，一般差異控制在2℃以內(nèi)。（引物的退火溫度相差小于5℃一般不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～70℃間變化）一般采用較低引物Tm值-5℃作為PCR退火溫度。一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5'端加上一些A或T。第十頁(yè)，共55頁(yè)。4.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)

引物二聚體（引物間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性？或互補(bǔ)性

）所謂引物二聚體實(shí)質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進(jìn)行延伸所形成的與二條引物長(zhǎng)度相近的雙鏈DNA的片段，是PCR常見(jiàn)的副產(chǎn)品，有時(shí)甚至成為主要產(chǎn)物。盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ)第十一頁(yè)，共55頁(yè)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)（引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp

）發(fā)夾結(jié)構(gòu)：DNA通過(guò)自身回折使得互補(bǔ)的堿基對(duì)相遇，也就是引物有部分可以自身配對(duì)尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。第十二頁(yè)，共55頁(yè)。5.引物3’端引物的延伸從3’端開(kāi)始，因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗。引物3’端的堿基一般不用A（3’端堿基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。

3’端的連續(xù)3個(gè)G或C，如GGG或CCC，會(huì)導(dǎo)致引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)第十三頁(yè)，共55頁(yè)。6引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基（對(duì)PCR影響不大），常在5’端引入修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。第十四頁(yè)，共55頁(yè)。7.引物的內(nèi)部穩(wěn)定性過(guò)去認(rèn)為，引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3’端最好為G或C?，F(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5’端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T（有說(shuō)不適宜用A），少用G或C。若模板不很清楚，引物3’端最后一個(gè)堿基最好為T，其次是G或C，而不選A，國(guó)外資料表明，當(dāng)末位為T時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下也能引發(fā)鏈的合成，而末位為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)大大降低，G或C居中，可見(jiàn)，模板很清楚時(shí)選A可以提高特異性第十五頁(yè)，共55頁(yè)。8.自由能分布ΔG值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般3’端ΔG值不要超過(guò)9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。3′末端雙鏈的ΔG是0～－2kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在－6時(shí)只有40%、到－8時(shí)少于20%、而－10時(shí)接近于0。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。

第十六頁(yè)，共55頁(yè)。常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析使用BLAST、PrimerPremier5CP（coatprotein)設(shè)計(jì)CP引物【序列查找和下載】第十七頁(yè)，共55頁(yè)。第十八頁(yè)，共55頁(yè)。第十九頁(yè)，共55頁(yè)。第二十頁(yè)，共55頁(yè)。第二十一頁(yè)，共55頁(yè)。第二十二頁(yè)，共55頁(yè)。第二十三頁(yè)，共55頁(yè)。序列同源比較第二十四頁(yè)，共55頁(yè)。第二十五頁(yè)，共55頁(yè)。第二十六頁(yè)，共55頁(yè)。第二十七頁(yè)，共55頁(yè)。PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence第二十八頁(yè)，共55頁(yè)?；拘畔equencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction第二十九頁(yè)，共55頁(yè)。引物設(shè)計(jì)界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer第三十頁(yè)，共55頁(yè)。引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度第三十一頁(yè)，共55頁(yè)。搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為滿分每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物第三十二頁(yè)，共55頁(yè)。引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer第三十三頁(yè)，共55頁(yè)。引物編輯第三十四頁(yè)，共55頁(yè)。引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。第四Falsepriming檢查第三十五頁(yè)，共55頁(yè)。引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow第三十六頁(yè)，共55頁(yè)。二、引物設(shè)計(jì)提高篇用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記蛋白NR1第三十七頁(yè)，共55頁(yè)。SPpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第三十八頁(yè)，共55頁(yè)。SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第三十九頁(yè)，共55頁(yè)。SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP第四十頁(yè)，共55頁(yè)。121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa

NR1的編碼序列(~4000bp)紅色為信號(hào)肽,藍(lán)色為BamHI酶切位點(diǎn),下劃線標(biāo)出酶切位點(diǎn)的閱讀框第四十一頁(yè)，共55頁(yè)。ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)第四十二頁(yè)，共55頁(yè)。引物設(shè)計(jì)要求PCR擴(kuò)增GFPGFP兩邊添加BamHI酶切位點(diǎn)保證NR1的閱讀框不改變第四十三頁(yè)，共55頁(yè)。5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’

TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’

TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：擴(kuò)增GFP基本序列變性,引物復(fù)性第四十四頁(yè)，共55頁(yè)。第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第四十五頁(yè)，共55頁(yè)。第三步：酶切位點(diǎn)Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5’ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第四十六頁(yè)，共55頁(yè)。酶切位點(diǎn)的閱讀框第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcg

gat

cccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct…..Primer1:5’

ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：Primer1:5’

ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA粘性末端插入后發(fā)生GFP讀框移碼突變第四十七頁(yè)，共55頁(yè)。AAG是GFP的最后一個(gè)密碼子，而gat必須作為一個(gè)3聯(lián)體密碼，因此引起NR1發(fā)生移框突變。atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacctNR1序列：5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

GFP序列cgcgcggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

……………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct插入GFP后的組合序列第四十八頁(yè)，共55頁(yè)。Primer2:5’

ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2:5’

ggatccct

CTTGTACAGCTCGTCCATGCC相當(dāng)于在GFP的最后一個(gè)密碼子AAG后面加了AG第四十九頁(yè)，共55頁(yè)。cgcgcg

gatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

……………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAGggatcccgaccccaag