基因工程基因重組(DNA重組):將不同來(lái)源的DNA分子通過磷酸二酯鍵連接而形成新的DNA分子的過程基本概念克隆(clone)是指通過無(wú)性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體分子克隆是在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得DNA分子大量復(fù)制，并使受體細(xì)胞獲得新的遺傳特征的過程。

基因工程的概念：

利用DNA體外重組或PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過程.1、從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)，并與之一起增殖。4、從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。5、從這些篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。6、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線1996年7英國(guó)愛丁堡羅斯林（Roslin）研究所用藥物促使母羊排卵，將卵吸空，制成空卵殼，再?gòu)哪秆蛉橄僦腥〕鲆粋€(gè)體細(xì)胞，使它與卵殼合成一個(gè)含有遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞。當(dāng)卵細(xì)胞分裂形成胚胎后被植入母羊子宮內(nèi)，母羊產(chǎn)下了與自己有相同基因的多莉！

一、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是由細(xì)菌產(chǎn)生的一種能識(shí)別雙鏈DNA中的特定位點(diǎn)，并水解該點(diǎn)磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶)，多在原核生物中存在.⒈限制酶的分類①I型限制酶：具有限制和DNA修飾作用，這種酶通常在識(shí)別位點(diǎn)下游100～1000bp處切割DNA；②Ⅲ型限制酶：與I型酶一樣，具有限制與修飾活性，能在識(shí)別位點(diǎn)附近切割DNA，切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè).③Ⅱ型限制酶：能在DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)識(shí)別和切割雙鏈DNA，其切割位點(diǎn)的序列可知、固定,是基因工程常用酶。

⒉限制酶的命名第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株。另外用羅馬數(shù)字代表同一菌株中不同限制酶的編號(hào)，現(xiàn)在常用來(lái)表示發(fā)現(xiàn)的先后次序EcoRⅠ：E代表Escherichia屬co代表coli種R代表RY13株I代表該菌株中首次分離到的核酸內(nèi)切酶⑴粘性末端在識(shí)別序列的兩個(gè)對(duì)稱點(diǎn)切開DNA雙鏈，產(chǎn)生帶單鏈尾的粘性末端⒊限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)特點(diǎn)：4-8個(gè)bp，具有回文結(jié)構(gòu)的DNA片段BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口⑶特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制酶：同裂酶：又稱異源同工酶，是從不同的原核生物中分離出來(lái)的不同的酶。它們識(shí)別相同的序列，在切割DNA時(shí)，其切割點(diǎn)可以是相同的，也可以是不同的。例如：AhaⅢ和DraⅠ的識(shí)別和切割序列都相同，產(chǎn)生平端：又如KpnⅠ和Asp718Ⅰ的識(shí)別位點(diǎn)相同，但切割位點(diǎn)不相同，前者產(chǎn)生3'粘性末端，而后者產(chǎn)生5'粘性末端二、DNA聚合酶(一)DNA聚合酶I

①催化DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNA探針；②第二條cDNA鏈的合成；③對(duì)DNA3‘突出末端標(biāo)記；④DNA序列分析。(二)Klenow片段用枯草桿菌蛋白酶可將DNA聚合酶I裂解為36kD和76kD兩個(gè)片段，大片段稱為Klenow片段.具有5'→3'聚合酶活性及3'→5'外切酶活性，而失去了5'→3'外切酶活性。它具有的3'→5'外切酶活性能保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，把DNA合成過程中錯(cuò)誤配對(duì)的核苷酸去除，再把正確的核苷酸接上去。(三)TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一種依賴DNA的耐熱DNA聚合酶

主要用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，能以DNA為模板，以結(jié)合在模板上的引物為起點(diǎn)，以dNTP為原料，按堿基配對(duì)方式，從5'→3'方向合成新的DNA鏈。TaqDNA聚合酶在70～75oC時(shí)具有最佳的生物活性，隨著溫度的降低，酶活性明顯下降。同時(shí)此酶缺乏3'→5'外切酶活性，無(wú)校正功能。三、逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA的DNA聚合酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶，合成的DNA產(chǎn)物稱為互補(bǔ)DNA(cDNA)。應(yīng)用于：①將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)；②補(bǔ)平和標(biāo)記5'-末端突出的DNA片段；③代替Klenow酶用于DNA序列分析；④制備雜交探針等。四、DNA連接酶DNA連接酶催化雙鏈DNA一端3‘端羥基與另一雙鏈DNA的5’端磷酸基連接，形成3‘,5’-磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端連接起來(lái)。從而把兩個(gè)DNA分子連接起來(lái)，或連接雙鏈DNA中一條鏈的切口最常用的DNA連接酶是由T4噬菌體編碼的T4DNA連接酶。要求：兩個(gè)雙鏈DNA片段間存在互補(bǔ)的粘性末端或平頭末端第二節(jié)基因克隆常用的載體

概念：載體(vector)是指能在連接酶作用下和外源DNA片段連接，實(shí)現(xiàn)外源DNA的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的DNA分子。

外源DNA一般沒有明顯的遺傳標(biāo)志，如果將其直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，沒有有效的方法能將導(dǎo)入了外源DNA片段的細(xì)胞和未導(dǎo)入外源DNA的細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。

外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，不能隨宿主細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，即沒有自主復(fù)制能力，達(dá)不到使外源DNA片段擴(kuò)增的目的。多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體(二)表達(dá)型載體(expressionvector)：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體?！舯磉_(dá)型載體除具有克隆載體所具有的特性外還具備表達(dá)系統(tǒng)元件◆原核表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)元件是啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)◆真核表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)元件是啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-終止信號(hào)和poly(A)信號(hào)粘粒(cosmid)(超純質(zhì)粒)λ噬菌體(λphage)

質(zhì)粒（plasmid）近年來(lái)發(fā)展了一系列新的載體系統(tǒng)，它們能在細(xì)菌中擴(kuò)增，在真核細(xì)胞中表達(dá)。病毒載體(virus)

M13噬菌體(M13phage)載體(vector)主要類型：二、常用的載體(一)質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外的遺傳單位，是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子，其結(jié)構(gòu)比病毒更簡(jiǎn)單，無(wú)蛋白外殼，也無(wú)細(xì)胞外的生命周期，是僅能存在于宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、獨(dú)立于染色體的、自主復(fù)制的遺傳成分常用質(zhì)粒載體舉例1、pBR322載體2、pUC載體1、pBR322載體優(yōu)點(diǎn)：1、分子量較小，為4363bp，不僅利于自身DNA的純化，可容納的外源DNA也較大。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。3、具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增后，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000-3000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。2、pUC18和pUC19

pUC系列質(zhì)粒載體具有三個(gè)顯著特點(diǎn)：（1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。（2）含易于檢測(cè)是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。（3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。每一種限制性內(nèi)切酶會(huì)產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源DNA上產(chǎn)生相同的末端，進(jìn)行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。

pUC18和pUC19載體第三節(jié)重組DNA基本原理1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達(dá)一、目的基因的獲取(一)制備基因組DNA文庫(kù)

采用限制酶將基因組DNA切成片段，每一DNA片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為基因組文庫(kù)(genomiclibrary)。用適當(dāng)?shù)暮Y選方法從菌落中選出含有某一基因的菌落，再行擴(kuò)增，將重組DNA分離、回收，獲得目的基因的克隆?；蚪MDNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝(二)制備cDNA文庫(kù)

以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成其互補(bǔ)DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，擴(kuò)增為cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)。采用適當(dāng)方法從cDNA文庫(kù)中篩選出目的cDNA。在細(xì)胞中，表達(dá)基因一般僅占基因總數(shù)的15%左右，所以從mRNA出發(fā)分離目的基因極大地縮小了搜索目的基因的范圍。cDNA文庫(kù)的組建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA(三)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

如果知道目的基因的全序列或其兩側(cè)序列，可以通過合成一對(duì)與模板DNA互補(bǔ)的引物采用PCR方法即可有效地分離目的基因。PCR方法十分簡(jiǎn)捷。現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展到今天，人類基因組全序列已經(jīng)測(cè)出，并且越來(lái)越多的生物的基因組全序列正在被測(cè)出，PCR方法已經(jīng)成為分離目的基因的主要手段。(四)人工合成基因

人工合成基因需先知道目的基因的結(jié)構(gòu)與核苷酸序列及其他相關(guān)的基因信息。應(yīng)用DNA測(cè)序技術(shù)能測(cè)定基因的核苷酸序列，同時(shí)也可以通過氨基酸序列分析反推核苷酸序列。通過化學(xué)合成的方法合成目的基因。適用于小DNA分子質(zhì)量的基因。二、目的基因與載體的連接(一)粘性末端連接(二)平頭末端連接(三)人工接頭法(四)同源多聚尾連接法粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA(三)人工接頭法

人工接頭主要用于在DNA分子的平頭末端上添加新的內(nèi)切酶位點(diǎn)，產(chǎn)生粘性末端，以提高連接效率。目前此方法常用于基因克隆、文庫(kù)構(gòu)建等操作中。人工接頭連接BamHIBamHIBamHI同聚物加尾連接5’5’5’5’AAA

AAATTTTTTTdT酶連接酶(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)三、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

外源DNA(含目的DNA)與載體在體外連接成重組DNA分子后，需將其導(dǎo)入受體細(xì)胞(形成轉(zhuǎn)化子)。隨受體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，重組DNA分子也復(fù)制、擴(kuò)增，這一過程即為無(wú)性繁殖。

進(jìn)行無(wú)性繁殖時(shí)所采用的受體細(xì)胞又稱宿主細(xì)胞，在選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后，經(jīng)特殊方法處理，使之成為感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)，具備接受外源DNA能力。

用作受體細(xì)胞的原核生物主要是E.coli、鏈球菌及枯草桿菌等，可用于重組體復(fù)制與表達(dá)。真核生物包括酵母、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，主要用于外源真核基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化在基因克隆技術(shù)中，將質(zhì)粒DNA及其重組體導(dǎo)入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)；轉(zhuǎn)染病毒及其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染(transfection)；轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體及其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。根據(jù)重組載體和宿主細(xì)胞的不同，運(yùn)用不同的名詞描述進(jìn)入過程：四、目的基因的篩選和鑒定

將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞以后，首要任務(wù)是篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等

最常見的載體攜帶的標(biāo)志是抗藥性標(biāo)志，如抗氨芐青霉素基因（Ampr）、抗四環(huán)素基因(tetr)、抗卡那霉素基因(kanr)等。當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細(xì)胞全部篩除掉了。

如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個(gè)抗藥性標(biāo)志就會(huì)消失。例如質(zhì)粒pBR322含有Ampr、和tetr兩個(gè)抗藥基因，若將目的序列插入tetr基因序列中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，讓細(xì)菌放在含氨芐青霉素或四環(huán)素培養(yǎng)基中，凡未接受質(zhì)粒DNA的細(xì)胞都不能生長(zhǎng)；凡在含氨芐青霉素和四環(huán)素中都能生長(zhǎng)的細(xì)菌是含有質(zhì)粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生長(zhǎng)、而在四環(huán)素中不能生長(zhǎng)的細(xì)菌就很可能是含有目的序列的重組質(zhì)粒。1、遺傳檢測(cè)法1）抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmprTetr插入片段Amp平板Tet平板⑵藍(lán)-白篩選(?-半乳糖苷酶法、α-互補(bǔ)檢測(cè)法)

β-半乳糖苷酶是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，分別由兩個(gè)基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。lacZ（lacZα）中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)無(wú)外源DNA片段插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá)β—半乳糖苷酶的α-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼α-肽）表達(dá)的lacZ基因產(chǎn)物（β鏈）互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷)的存在下(誘導(dǎo)物IPTG可誘導(dǎo)α片段的合成，有活性的β—半乳糖苷酶能水解底物X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色化合物。)菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了lacZα-肽基因的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)不能產(chǎn)生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。

PLacZαLacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)的菌落復(fù)印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標(biāo)記，結(jié)合了放射性核酸探針的菌落集團(tuán)可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來(lái)，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標(biāo)記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來(lái)。

2、原位雜交技術(shù)

3、PCR法

PCR技術(shù)的出現(xiàn)給克隆的篩選增加了一個(gè)新手段。如果已知目的序列的長(zhǎng)度和兩端的序列，則可以設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以轉(zhuǎn)化細(xì)胞所得的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化細(xì)胞就可能含有目的的序列。4、限制酶切圖譜鑒定DNA分子上每種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列分布圖，稱限制性圖譜（restriction

map）或稱物理圖譜(physical

map)。

這是在上述篩選后的進(jìn)一步分析。目的序列插入載體會(huì)使載體DNA限制性酶圖譜（restrictionmap）發(fā)生變化，例如一個(gè)長(zhǎng)600bp的目的序列利用它兩端的EcoRI和SalI切后的粘末端連接插入pUC19的多克隆點(diǎn)，則重組質(zhì)粒就增大為3.3kb，用EooRI和SalI雙酶切后會(huì)出現(xiàn)600bp和-2.7kb兩個(gè)DNA片段，提取轉(zhuǎn)化細(xì)菌的質(zhì)粒DNA作酶切后做電泳觀察其酶切圖譜，就能分析得結(jié)果；如插入的目的序列中有其它限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。這就可以進(jìn)一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。5、核苷酸序列測(cè)定

所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列測(cè)定來(lái)最后鑒定。已知序列的核酸克隆要經(jīng)序列測(cè)定確證所獲得的克隆準(zhǔn)確無(wú)誤；未知序列的核酸克隆要測(cè)定序列才能確知其結(jié)構(gòu)、推測(cè)其功能，用進(jìn)一步的研究。因此核酸序列測(cè)定是分子克隆中必不可少的鑒定步驟。外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）受體細(xì)胞

人類對(duì)大腸桿菌經(jīng)過長(zhǎng)期的研究，對(duì)其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達(dá)工具已有二十多年的經(jīng)驗(yàn)積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%。因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。

要表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系統(tǒng)優(yōu)越，常用的酵母、昆蟲、動(dòng)物和哺乳類細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)載體至少要含兩類序列：①原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。②在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號(hào)序列、mRNA剪接信號(hào)序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)等。基因載體目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫(kù)限制