環(huán)境生物技術第七章第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日

第四節(jié)

環(huán)保型型微生物制劑的開發(fā)應用環(huán)保型微生物制劑指將具有特定功能的有益微生物大量繁殖后制成活菌體或菌體產(chǎn)生的特定物質的產(chǎn)品，應用于環(huán)境，起到治理污染，改善環(huán)境質量及保護環(huán)境的作用。從源頭控制污染，保持生態(tài)平衡，符合可持續(xù)發(fā)展原則。一、微生物降解劑二、微生物農藥

三、微生物肥料四、生物表面活性劑

五、生物塑料六、微生物絮凝劑第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日一、微生物降解劑對污染物降解能力強的菌株擴大生產(chǎn)、制成產(chǎn)品，應用于環(huán)境的無害化處理，即是微生物降解劑。降解的對象是氰和腈化物、苯和酚、硝基化合物、石油烴類、氯苯和農藥、洗滌劑等多種有機物；還包括染料脫色菌、重金屬吸附并轉化菌、混合降解菌等。（難處理的）第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日生物強化技術通過向廢物處理系統(tǒng)中直接投加從自然界中篩選的優(yōu)勢菌種或通過基因重組技術產(chǎn)生的高效菌種，以改善原處理系統(tǒng)的能力，達到對某一種或某一類有害物質的去除或某方面性能改進的目的的環(huán)境生物技術。應用：處理有毒有害難降解廢水的處理如：制藥廢水、印染廢水；微污染水源水的處理（生物強化過濾有效去除氨氮、亞硝酸鹽、有機物、鐵、錳、濁度、色度等）；垃圾滲濾液的處理（如用日本專利產(chǎn)品EM菌劑）。第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日二、微生物農藥1.定義：利用微生物或其基因產(chǎn)生或表達的各種生物活性成分，用于防治植物病蟲害、雜草、鼠害各種制劑的總稱。

2.特點：高效低毒，對人畜安全無毒，不殺傷害蟲的天敵和有益生物；無殘留，不污染環(huán)境，利于保持生態(tài)平衡；許多是由

多種有效成分構成的，害蟲和病原菌難以產(chǎn)生抗藥性；生產(chǎn)工藝設備簡單，明顯的開發(fā)優(yōu)勢。第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日1．細菌殺蟲劑

蘇云金芽孢桿菌開發(fā)最早，應用最成功，占細菌殺蟲劑總量的95％以上。對800余種昆蟲有不同程度的致病性，對20多種重要農作物害蟲防治效果顯著。伴胞晶體：芽孢形成的過程中另一端同時形成伴胞晶體。形態(tài)多種多樣，主要有菱形、球形、方形、多邊形和不規(guī)則形。是一種蛋白質，又稱δ－內毒素，是主要的殺蟲物質。微生物農藥的主要品種簡介

第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日1．細菌殺蟲劑

90年代以來，第二代細胞工程殺蟲劑和第三代基因工程殺蟲劑相繼投入市場。90年代初被批準登記或進入田間試驗的有10余中遺傳重組殺蟲劑。通過構建重組菌可以實現(xiàn)以下目標：擴大殺蟲譜；延長殺蟲毒素的特效期及改善釋放性能；提高毒力和殺蟲晶體蛋白的產(chǎn)量。微生物農藥的主要品種簡介

第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日伴胞晶體的殺蟲原理伴胞晶體原毒素腸道堿性條件活性毒素片斷蛋白酶作用昆蟲中腸上皮細胞糖蛋白受體離子通道滲透平衡破壞細胞膨脹并瓦解

芽孢從穿孔部位進入血腔，萌發(fā)成營養(yǎng)細胞并迅速繁殖，害蟲得敗血癥死亡

第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日2．病毒殺蟲劑昆蟲病毒突出的特點是它們大都在宿主細胞內形成蛋白結晶性質的包含體（inclusionbody）。根據(jù)包含體在寄主細胞中的部位，可分為：（1）核型多角體病毒（(NPV)），多角體于細胞核內形成，包含體內含有多個病毒粒子。（2）質型多角體病毒(CPV)），多角體于細胞質內出現(xiàn)，包含體內含有多個病毒粒子；（3）顆粒體病毒(GV)，橢圓形顆粒狀包含體存在于細胞核或細胞質內。微生物農藥的主要品種簡介

第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日殺蟲機理在宿主消化道的堿液中包含體被破壞，釋放出病毒顆粒。病毒顆粒進入宿主的腸上皮細胞進行復制，以出芽的方式從細胞中釋放出來，進入血淋巴，或是在感染的組織中生成大量的包含體病毒。宿主死亡分解后，包含體可以較長時間保護病毒使之不失去感染力。第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日病毒殺蟲劑國際上：試制20多種病毒殺蟲劑，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的只有幾種，如美洲棉鈴蟲NPV殺蟲劑、舞毒蛾NPV殺蟲劑、黃杉毒蛾NPV殺蟲劑、赤松毛蟲CPV殺蟲劑。我國：中國棉鈴蟲NPV殺蟲劑、油桐尺蠖NPV殺蟲劑、斜紋夜蛾NPV殺蟲劑、松毛蟲NPV殺蟲劑、菜粉蝶

GV殺蟲劑以及病毒殺蟲劑。第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日3．真菌殺蟲劑白僵菌（Beaurevia）是廣譜性寄生真菌，既可以在活體昆蟲體內寄生，又可以營腐生生活，能侵染鱗翅目、鞘翅目、直翅目等的多種昆蟲及螨類。白僵菌的孢子侵染蟲體后，適宜條件下分生孢子萌發(fā)，在昆蟲體內增殖，并分泌毒素和草酸鈣結晶，破壞寄主組織，使寄主代謝紊亂，最后在蟲體上生出白色的棉絮狀菌絲和分生孢子梗及孢子堆，蟲體變成白色僵尸。第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日我國使用白僵菌防治松毛蟲、松針毒蛾、油桐蚜蟲、茶葉毒蛾、大豆食心蟲、楊樹天牛、玉米螟、水稻葉蟬等害蟲。注意：白僵菌能感染家蠶，養(yǎng)蠶地區(qū)控制使用；人體吸入大量的孢子類似感冒，操作者要進行適當?shù)姆雷o。第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日4．殺蟲抗生素—阿維菌素

—大環(huán)內酯類抗生素

神經(jīng)末梢受體γ－氨基丁酸

阿維菌素

促進γ－氨基丁酸釋放進入細胞的氯離子增加，細胞膜超極化細胞膜受體神經(jīng)信號傳遞受抑

產(chǎn)生菌為阿維鏈霉菌對昆蟲、線蟲、螨蟲有很好的殺除效果。促進結合于第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日5．原生動物殺蟲劑孢子是微孢子蟲生活史中唯一可在宿主細胞外生存的發(fā)育階段，即本蟲的感染期。

孢子寄主細胞釋放原孢質分裂體二分裂或多分裂重復感染或形成母孢子孢子第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日6、防病抗生素井岡霉素產(chǎn)生菌是吸水鏈霉菌井岡變種。井岡霉素是用量最大的農用抗生素，對水稻的紋枯病、其他作物的立枯絲核菌引起的病害都有良好的防治作用。第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日三、微生物肥料

（一）定義及種類利用有益微生物為植物提供有效養(yǎng)料和促進生長的微生物制劑。分為兩類，一類是增加植物營養(yǎng)的供應量，代表是根瘤菌肥料；另一類是通過生長刺激素對植物的刺激作用，促進對植物營養(yǎng)元素的吸收，或是拮抗某些病原微生物的致病作用，減輕病蟲害而導致產(chǎn)量增加，是廣義的生物肥料，植物根際促生菌即屬此類。第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日三、微生物肥料

微生物肥料比化學肥料的優(yōu)點：長期使用不會造成環(huán)境的污染與危害，作為有益的微生物群體中的一分子。但還不能從營養(yǎng)角度完全滿足作物生長的需要，不能全部取代化肥，而是減少化肥的用量。第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（二）主要微生物肥料1.根瘤菌肥料根瘤中細菌以多形態(tài)(類菌體)出現(xiàn)，呈棒狀、T型、Y型。根瘤的結構有利于保護根瘤菌，防止其他微生物的競爭。植物與根瘤菌是互惠共生關系，植物通過光合作用合成糖類，輸送到根瘤，供給根瘤菌能源，根瘤菌固氮把空氣中的分子氮轉化為化合態(tài)氮，再轉化為谷氨酸和谷氨酰類隨時輸出供給植物利用，利用率可達100％，不污染環(huán)境。第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（二）主要微生物肥料2.植物根圈促生菌劑大多數(shù)植物根圈促生菌產(chǎn)生鐵載體，將鐵螯合起來，限制有害微生物生長；或產(chǎn)生一種或多種抗生素抑制或殺死多種病原體；或對雜草有害；或誘導植物產(chǎn)生整體抗性。第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（二）主要微生物肥料3.菌根菌真菌和植物根以互惠共生關系建立起來的共生體稱為菌根。外生菌根的真菌菌絲在根外形成致密的鞘套，少量菌絲進入根皮層細胞的間隙中。植物根為真菌的生長提供能源，菌根菌為植物提供礦物質和水，還可產(chǎn)生植物之間的抑制物質，使生長植物對其他植物存在偏害關系，削弱外來者的競爭，以保持占據(jù)的生境。第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日四、生物表面活性劑

(一)

生物表面活性劑的定義及性質生物在一定的生長條件下，在其代謝過程中分泌產(chǎn)生的具有一定的表面或界面活性的代謝產(chǎn)物。理化性質同化學合成的表面活性劑相似，但活性更高、無毒性，易被微生物降解，不會對環(huán)境造成二次污染，有可能成為化學合成表面活性劑的替代品。第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日結構特點：非極性疏水基：一般為脂肪酰基鏈。極性的親水基：有多種形式，如中性脂的酯或醇功能團、脂肪酸或氨基酸的羧基、磷脂中含磷的部分以及糖脂中的糖基。糖脂不溶于水，非極性糖脂溶于氯仿等憎水溶劑，而極性糖脂溶于氯仿/甲醇混合溶劑。第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（二）生物表面活性劑的種類按用途可分為生物表面活性劑和生物乳化劑。生物表面活性劑是分子量低的小分子，能顯著改變表面/界面張力。生物乳化劑是一些大分子物質，雖不能顯著降低表面/界面的張力，但對油水界面表現(xiàn)出很強的親和力，防止油滴凝聚，從而使乳狀液穩(wěn)定。依據(jù)他們的化學組成可分為糖脂、脂肽和脂蛋白、中性脂/脂肪酸、磷脂、聚合物和全細胞表面本身等。第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（三）生物表面活性劑的生產(chǎn)1.

生產(chǎn)生物表面活性劑的菌株由很多種類的微生物如細菌、放線菌、酵母菌等合成。培養(yǎng)基的碳源可分為3類：一類是以烷烴作為碳源的微生物，如棒狀桿菌；一類是以水溶性底物為碳源的微生物如芽孢桿菌；第三類是以烷烴和水溶性底物兩者為碳源的微生物，如假單胞菌。

第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日2.表面活性劑合成的代謝調節(jié)碳源的影響：培養(yǎng)基中的碳源是決定生物表面活性劑結構和產(chǎn)量的重要因素，有的微生物僅在烴類培養(yǎng)基上生長時才產(chǎn)生生物表面活性劑，但也有的只需要一些糖類和氨基酸就可以產(chǎn)生。可以通過向培養(yǎng)基中加入長鏈脂肪酸、烴、甘油酯等油性物質誘導，是目前研究最多的調節(jié)方式。添加烴的類型很重要，有的細菌生產(chǎn)表面活性劑對烴類有一定的專一性。第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日氮源及其他因素的影響：如C/N比可以決定假單胞菌對糖脂的生產(chǎn)；NaNO3

是石蠟酪桿菌B126合成糖脂的適宜N源，用銨鹽作N源則產(chǎn)量較低。提高產(chǎn)率的方法：調節(jié)碳源（烷烴、蔗糖）、氮源；低稀釋率；誘變篩選或構建工程菌。第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日應用于石油開采業(yè)(石油開采微生物技術，ＭＥＯＲ技術)（1）微生物強化采油技術

往油層中注入某些微生物和營養(yǎng)物質，微生物產(chǎn)生表面活性物質。降低原油與水兩相界面的張力，使地層毛細管孔隙中夾持的原油大量釋放出來，從而提高原油采收率。微生物不但可沿注水壓差方向移動，還可在油層中縱深遷移，能與水驅難以掃及的原油作用，大大提高波及效率。還會產(chǎn)生某些小分子的有機酸、有機溶劑等，既能降低油水界面張力，又使油層的通透性增強。第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日鼠李糖脂與石油磺酸鹽PSD-2復配，使大慶原油的界面張力大大下降。發(fā)酵液與磺酸鹽B-100復合使用，使表面張力降得更低，比水驅采油提高采收率20%，成為高效廉價驅油劑。第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日2、在環(huán)境生物工程上的應用

增溶作用和乳化作用。污染環(huán)境中加入微生物或表面活性劑(生物的或化學合成的),能夠增強憎水性化合物的親水性和生物可利用性,使進入環(huán)境的污染物不斷地降解，有助于污染環(huán)境的生物修復。糖脂類生物表面活性劑不僅可提高烷烴的去除率,而且可加速烷烴的礦化程度,縮短可被微生物利用的適應時間。第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日3、在食品工業(yè)和精細化工中的應用

蔗糖酯、卵磷脂、山梨聚糖等都是目前食品工業(yè)常用的乳化劑。另外,生物表面活性劑還可以用作食品加工業(yè)和精細化工中的保濕劑、防腐劑、潤濕劑、起泡劑、增稠劑、潤滑劑等。如生物乳化劑作色拉調味劑。槐糖脂具有良好的皮膚親和性，可作為皮膚保濕劑用于化妝品中。蔗糖酯也可以改善化妝品的洗滌性能，增加皮膚的光潤和滑膩性。第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（五）問題和發(fā)展前景

問題：生產(chǎn)成本較高3～10倍解決策略：

(1)通過選育高產(chǎn)菌株

(2)找到廉價發(fā)酵原料（3）改進發(fā)酵工藝、用先進的下游技術（4）開發(fā)出它的二次產(chǎn)品,提高其附加值。第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日五、生物塑料已經(jīng)商品化的可生物降解塑料主要包括脂肪族聚酯、淀粉-聚乙烯、熱塑性淀粉共混物、聚乳酸和聚己內酯。（一）聚β－羥基烷酸（PHAs）的結構當R為甲基、m為1時，單體為β－羥基丁酸（HB），聚合物為PHB。兩種或兩種以上的單體還能形成共聚物，典型代表為PHBV，是β－羥基丁酸和β－羥基戊酸（HV)的聚合物。第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日線狀的β－羥基烷酸的聚酯。多聚物的相對分子質量可高達2x106

；PHB是100％立體專一性的，所有不對稱碳原子都是D(-)構型，因此PHB是高度結晶的晶體。

在物理性質甚至在分子結構上與聚丙稀很相似，如熔點、玻璃態(tài)溫度、結晶度、抗張度等，并且具有相對密度大、透氧率低、抗紫外線照射、具有光學活性、阻濕性和壓電性等優(yōu)點。PHAs的理化性質第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日PHAs的用途PHAs這類熱塑性聚酯可以紡絲、壓膜或注塑，在工業(yè)上可以用作各類包裝材料；農業(yè)上用作農用薄膜、長效農藥或肥料的生物降解載體；在醫(yī)藥方面可作外科縫線、骨骼代用品或骨板、術后無需取出，還可用于血管替代品，長效藥物的生物降解載體。

第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日PHB的生物相容性：研究發(fā)現(xiàn)，PHB的降解產(chǎn)物D(-)－3－羥基丁酸是普遍存在于高等動物中的中間產(chǎn)物，在原核生物真核生物中發(fā)現(xiàn)的含有100－200個單體的小分子量的PHB具有組成細胞膜離子通道組成的作用，并且在人體血漿中也檢測到它的大量存在。因而有理由相信，植入哺乳動物組織的PHB不會對機體產(chǎn)生毒性作用。第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日PHB存在兩個缺點：一是融化穩(wěn)定性較差：其分解溫度約為200度，與熔點（175度）相近?？赏ㄟ^發(fā)酵過程中加入3－HV的前體合成PHBV共聚體或將PHB與其他多聚物混合使用來解決；二是易老化發(fā)脆：可以通過簡單的淬火處理來解決。第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（二）PHAs的微生物合成1.

合成PHAs的主要微生物目前研究較多的用于合成PHAs的微生物有：產(chǎn)堿桿菌，假單胞菌屬，甲基營養(yǎng)菌，固氮菌屬；紅螺菌屬。這些微生物分別利用不同的碳源生產(chǎn)不同的PHAs。最初用來生產(chǎn)的有真氧產(chǎn)堿桿菌、固氮菌和甲基營養(yǎng)菌，但固氮菌的PHB產(chǎn)量低，甲基營養(yǎng)菌的PHB分子量小而被淘汰。目前大多采用真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌和重組大腸埃希氏菌。第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日PHAs的合成及調控

PHAs的發(fā)酵生產(chǎn)中，將發(fā)酵分為兩個階段進行控制：第一階段為菌體細胞的形成階段，在此階段微生物利用基質形成大量的菌體，而PHAs的積累很少；第二階段為多聚體形成階段，當?shù)⒘?、鎂或氧某種營養(yǎng)耗盡時，細胞進入PHAs的形成階段，在此階段PHAs大量形成而菌體細胞基本不繁殖。

第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日PHAs的合成及調控

可采用流加發(fā)酵法對營養(yǎng)物質進行控制。菌體細胞形成階段，在某些必須的營養(yǎng)成分成為生長限制因素之前，對其進行定量流加，延長細胞的對數(shù)期，從而可獲得較高的菌體濃度。為減少生長階段對多聚體的積累，需通過流加法控制培養(yǎng)液中氨離子濃度不小于200mg/L，否則會降低多聚體的最終得率。而在多聚體形成階段，將以較低的速度限量流加氮源。流加法可以針對微生物生長和聚合物積累過程的特點實施靈活控制。第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（三）PHB的提取方法第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（三）PHB的提取方法第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（三）PHB的提取方法3.酶法提取

4.表面活性劑－次氯酸鈉法第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（四）PHB在環(huán)境中的降解PHB能被土壤中發(fā)現(xiàn)的295種微生物降解。PHBV在好氧污水污泥培養(yǎng)20oC、10周已降解大部分。降解的第一步是表面的－OH和－COOH基團數(shù)量增加，第二步是細菌解聚反應，解聚酶將高聚物降解成單體。假單胞菌的解聚酶可將PHB降解為3－羥基丁酸單體、二體和三聚體，從而進入細胞參與代謝。第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（五）PHAs的工業(yè)化與發(fā)展現(xiàn)狀PHAs以細菌發(fā)酵工藝為主，最初生產(chǎn)價格昂貴，（PHB15美元/kg）,缺乏相應的市場競爭力，難以大規(guī)模推廣應用。經(jīng)過努力和探索價格降至5.58美元/kg左右，但與聚丙稀的價格（1美元/kg）仍高出許多。主要研究：菌種的改良，提高對多種原料的利用能力和轉化率；發(fā)酵技術研究提高生產(chǎn)強度；新型反應器的研究提高傳氧效率；產(chǎn)品提取工藝的開發(fā)。第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（五）PHAs的工業(yè)化與發(fā)展現(xiàn)狀極端嗜鹽菌比普通細菌產(chǎn)生的PHAs中的PHV（聚β－羥基戊酸）含量較高，可解決目前以PHB（聚β－羥基丁酸）制備的塑料韌性不夠的問題；而且由于嗜鹽菌在低鹽中細胞自溶的特點，將大大簡化后處理生產(chǎn)工藝，有望降低成本，為目前生產(chǎn)的PHB由于價格問題而限制大規(guī)模生產(chǎn)提供新的出路。第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日第二節(jié)環(huán)保型微生物制劑的生產(chǎn)與使用一、菌種選育（一）選擇大規(guī)模生產(chǎn)的菌種的依據(jù)1.培養(yǎng)基價格低廉，培養(yǎng)條件要求不高且易控制；2.生長速度和代謝速度快，較短的培養(yǎng)周期內達到微生物量及目標代謝物量較高的目標；3.抗噬菌體能力強；4.菌種不易變異退化；5.不是人畜的病原菌，不產(chǎn)生污染環(huán)境、危害人體的活性物質。第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（二）自然篩選高效菌株1.準備工作（文獻調查、策略研究、方案設計）；2.采取標本（在適當?shù)沫h(huán)境中?。?；3.富集培養(yǎng)（投其所好，取其所抗）；4.平板分離；5.基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)；6.菌種初篩（平板或搖瓶發(fā)酵）；7.平板分離；8.搖瓶發(fā)酵復篩；9.平板分離；10.菌種搖瓶發(fā)酵復篩；11.接種較優(yōu)的菌種斜面，進一步性能鑒定，也可作為誘變育種出發(fā)菌株。第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期日（三）人工構建新菌株1.誘變育種2.原生質體融合復習原生質體融合的關鍵步驟：原生質體制備（脫去或破壞細胞壁，原生質體逸出）；原生質體融合（促融劑聚乙二醇加Ca2+

、Mg2+等陽性離子，或電融合技術）；原生質體再生（高滲培養(yǎng)基或加入蔗糖溶液增加再生率）；原生質體的選擇（營養(yǎng)缺陷型得到互補，或用熒光染色）。黃孢原毛平革菌、土著細菌