細(xì)胞因子檢測(cè)一類(lèi)生物活性物質(zhì)分泌的蛋白質(zhì),在體內(nèi)廣泛參與免疫調(diào)節(jié)及炎要作用。某些刺激因子也可導(dǎo)致一些細(xì)胞因子超量表達(dá),或表達(dá)其其基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原進(jìn)行定量株(即靶細(xì)胞)的促增殖作用，以增殖細(xì)胞中的DNA的合成或株(即靶細(xì)胞)的促增殖作用，以增殖細(xì)胞中的DNA的合成或原位雜交和PCR等.通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的基因組成或法、D10G4。1細(xì)胞增殖法及L929細(xì)胞增殖法等。IL1，或用P388D1(鼠),THP—1(人)細(xì)胞株制備IL－1。本4、將腹腔細(xì)胞用含10％小牛血清的RPMI－1640液(10%NBS-RPMI－1640)配成2×106/ml,加到24孔平底培S(二)L929細(xì)胞增殖MTT比色法omide,MTT)在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，被還原成蘭黑色的MTT－甲，形成MTT—甲的量與細(xì)胞增殖程度n6、將微量測(cè)定板置室溫?cái)?shù)分鐘，保證轉(zhuǎn)變的底物結(jié)晶被溶解.D(三)注意事項(xiàng)2、培養(yǎng)器皿和研磨條件:24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞活率較高，但生二、TNF的檢測(cè)(免疫學(xué)測(cè)定法，雙抗體ELISA夾心法)(一)原理選用兩種針對(duì)rHuTNF－α分子不同表位的單克隆(二)材料和試劑ml4、陰性對(duì)照液(未免疫鼠Ig).6、96孔ELISA板.8、包被緩沖液:0.05mol/L，pH9。6Na2CO3—NaHCO312、3％H2O2。13、血清、枸緣酸鹽或EDTA抗酸血漿、其它體液及細(xì)胞培養(yǎng)14、ELISA讀數(shù)儀等。(三)操作步驟ngmlngmlngml5pg/ml、312pg/ml、5、ELISA讀數(shù)儀測(cè)410nm處OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、標(biāo)本在2~8℃可儲(chǔ)存3天,超過(guò)3天應(yīng)放入-20℃或－7℃，避免反復(fù)凍融．4、疊氮鈉(NaN3)對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)有滅活作用,在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中應(yīng)避免使用.1。0。15mol／L，pH7。4PBSKH2PO40。2gNa2HPO4·12H2O2。9gNaCl8。0gKCl0．2g雙蒸水加至100mlNa2CO31。59gNaHCO32。93gTween200。5ml洗滌液100mlPEG(聚乙二醇，MW6000)2。0gNa2HPO4·12H2O1。79g6.ABS顯色液ABTS5mg底物緩沖液10ml3％H2O220μl細(xì)胞因子基因的檢測(cè)包括對(duì)其DNA的檢測(cè)和mRNA表達(dá)的檢RNA的測(cè)定(斑點(diǎn)雜交法)。將RNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸故很適合于臨床應(yīng)用。亦可用于DNA的檢測(cè)。但其缺點(diǎn)是不能(一)主要試劑No．117)3．DNA片段提取試劑盒：(LaJolla)10mmol／LTris.Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8．0)(2)溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖25mmol／LTris。Cl(pH8。0)10mmol/LEDTA(pH8。0)(3)溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/L貯存液稀min8。5ml(5)含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基(7)溶菌酶(10mg/ml，溶于10mmol／LTris．ClpH(8)無(wú)水乙醇(部分—20℃預(yù)冷).異丙醇。75%乙醇(部分(9)TE緩沖液(pH8。0)(10)5mol/LLiCl1.5ml(11)RNA酶，RPMI-1640,胎牛血清(FCS),ConA(刀豆蛋白A)等(13)3mol／LNaAc、飽和酚、氯仿:異戊醇(24：1)(二)主要儀器(三)IL—2質(zhì)粒DNA探針的大量制備取含IL－2質(zhì)粒DNA的單個(gè)菌落置兩個(gè)25mlLB培養(yǎng)基(含100μg/mlAmp)↓37℃150r/min振搖4h菌液倒入300ml離心管中離心棄上清，加5ml溶液Ⅰ(冰預(yù)冷)懸浮細(xì)菌，加1ml新配制(pH8．0)的溶菌酶(10mg/ml)心用75%乙醇洗滌沉淀一次(不將沉淀懸浮),倒出乙醇，倒置吸用1。5mlTE(pH8.0)將沉淀溶解,加等體積冰預(yù)冷的5MLiC用500μlTE(pH8．0)溶解DNA沉淀,移至新EP管中，加加等體積(500μl)含13％(W/V)PEG(800)的1。6mol/LNaCl，充分混合↓4℃12000r／min×5min離心吸去上清，用400μlTE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀加等體積飽和酚(400μl)混合吸上層水相移至另一EP管，加等體積氯仿：異戊醇(24：1)(pH5。2)和2體積的－20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻(可見(jiàn)沉淀次↓4℃12000r／min×5min離心去上清↓0.7％瓊脂凝膠電泳，確定有質(zhì)粒DNA后，用XhoIDW38μl3．用WizardTMPCR純化試劑盒回收IL—2DNA片段2)紫外燈下切下IL—2DNA片段，挑出凝膠到EP管中，加mlResinDNAmix轉(zhuǎn)移到WizardT(四)用DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒對(duì)IL—2探針進(jìn)行地高辛標(biāo)記出售的地高辛精標(biāo)記核苷酸有dig－UTP，dig—dUTP,和dig-ddUTP，它們分別適用于RNA探針，DNA探針和寡核苷高辛精DNA標(biāo)記試劑盒和地高辛檢測(cè)試劑盒在分子雜交中的A1.、將DNA(1μg~3μg)加熱95℃(或100℃)10min，隨鮮變性DNA;②2μl六聚核苷混合物(試劑5)；③2μldNTP(五)培養(yǎng)細(xì)胞RNA的提取(采用Trizol試劑盒提取RNA)3、于2~8℃離心14600r/min×15min,上層無(wú)色水相 RNA的溶解，用20μlDEPC處理的雙蒸水溶解RNA沉淀。RNA斑點(diǎn)雜交1、RNA變性:20μlRNA溶液(2μgRNA)40μl100％甲酰胺SCh3、濾器的處理及點(diǎn)樣:用0。1NNaOH浸泡(洗)多孔過(guò)濾加4、取出膜,80℃烤2~3h，膜保存于-20℃H2O至1000ml1NNaOH約0.5ml(1)預(yù)雜交2)先將預(yù)雜交液熱至60℃。3)將帶有目的RNA的硝酸纖維素膜放入稍寬于濾膜的塑料袋，4)盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，將其置60℃1)雜交液(DIGEasyHyb(20ml/100cm2)預(yù)溫輕振蕩30min2)將標(biāo)記探針DNA(5~25ng/ml)煮沸變性5min，迅速置冰水3)加入到預(yù)溫的DIGEasyHyb(2。5ml/100cm2)中混合,4)然后每張膜上注入預(yù)雜交液和滴加探針/DIGEasyHyb15min。(七)免疫測(cè)定3、抗地高辛—AP復(fù)合物(75mU/ml)用封閉緩沖液(1×)1∶10000稀釋?zhuān)?八)圖象分析結(jié)果用MPIAS—500多煤體彩色圖文分