本文格式為Word版，下載可任意編輯——土壤微生物數(shù)量測定土壤微生物數(shù)量測定

（一）培養(yǎng)基的制備：

Ⅰ測定微生物總量培養(yǎng)基：

1.細菌培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）牛肉膏Beefextract5.0g蛋白胨Peptone10.0gNaCI5.0g蒸餾水H201000m1

PH7.2~7.4

2.放線菌培養(yǎng)基（高氏1號瓊脂培養(yǎng)基）可溶性淀粉20gKNO31gK2HPO40.5gMgSO4?7H2O0.5gNaCl0.05gFeSO4?7H2O0.01gpH7.2-7.4

注：配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐一溶化其他成分，溶化后，補足水分到1000ml，調(diào)pH。

另：倒平板之前，在溶化的培養(yǎng)基中加重鉻酸鉀溶液，每300mL培養(yǎng)基加3%重鉻酸鉀1mL(l00ppm)。

3.真菌培養(yǎng)基（馬?。∕artin）-孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基）葡萄糖10.0gMgSO4.7H2OO.5g蛋白胨5.0g

孟加拉紅33.4mg（或者每升加1%溶液3.3mL）K2HPO41g蒸餾水H201000m1PH自然(4~5)

注：⑴滅菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加鏈霉素。⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培養(yǎng)基加0.lmL。

以上培養(yǎng)基皆加瓊脂15g/L。

Ⅱ測定功能菌所用培養(yǎng)基：

1.亞硝酸細菌培養(yǎng)基（改良的斯蒂芬遜（Stephenson）培養(yǎng)基A）(NH4)2SO42.0gNaH2PO40.25gMnSO4·4H2O0.01gMgSO4·7H2O0.03gK2HPO40.75gCaCO35.0g蒸餾水1000mlPH7.2

注：CaCO3最終加，不需要溶解，直接調(diào)PH，培養(yǎng)基中有這個成分是為了緩沖pH。由于硝化細菌的生長會產(chǎn)生酸化效應(yīng)，使得氫離子過剩，到了一定程度硝化作用將無法繼續(xù)，所以要堿性物質(zhì)平衡酸堿。下同。

2.硝酸細菌培養(yǎng)基（改良的斯蒂芬遜（Stephenson）培養(yǎng)基B）NaH2PO40.25gK2HPO40.75gMgSO4·7H2O0.03gMnSO4·4H2O0.01gCaCO31.0gNa2CO31.0gNaNO21.0g蒸餾水1000mlPH7.23.反硝化細菌培養(yǎng)基

檸檬酸鈉5.0gKNO32.0gKH2PO41.0g,K2HPO41.0gMgSO4·7H2O0.2g蒸餾水1000mlpH值7.2~7.5

4.好氣性自生固氮菌培養(yǎng)基（改良阿須貝(Ashby)無氮培養(yǎng)基）苯甲酸鈉1.5gK2HPO40.2gMgSO4·7H2O0.2gNaCl0.2gCaSO4·2H2O0.1gPH7.4—7.6

注：在培養(yǎng)基分裝入試管時，每管參與一1cm濾紙長條，要露出液面。

5.氨氧化細菌培養(yǎng)基（蛋白胨氨化培養(yǎng)基）K2HPO40.5gKH2PO40.5g,MgSO4·7H2O0.5g蛋白胨5.0g蒸餾水1000ml

PH7.0~7.2

6.好氣性纖維素分解菌培養(yǎng)基（依姆歇涅茨基纖維素分解菌培養(yǎng)基）KH2PO41.0gFeCl3·6H2O0.1gMgSO4·7H2O0.3gCaCl2·6H2O0.1gNaCl0.1gNaNO32.5g

pH7.2～7．4

注：在培養(yǎng)基分裝入試管時，每管參與一1cm濾紙長條，需露出液面。

(二)試劑的配制

1.格里斯試劑（GriessReagent）第一、其次液：

第一液：將0.5g的對氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

其次液：將0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）參與50ml蒸餾水中，煮沸后，緩緩參與150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。2.納氏試劑

甲液：將20.0g碘化汞和10.0g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。乙液：將20.0g氫氧化鉀溶于100ml水中。

分別配制甲、乙二液，待冷卻后混合，放置2天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，隨著沉淀增加會影響測定結(jié)果。3.二苯胺試劑：

溶1.0g無色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸餾水中，然后徐徐參與100ml濃硫酸（相對密度1.84）中，保存于棕色瓶中。（三）試驗器材：

1.儀器設(shè)備

4℃冰箱、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、微量移液器、全溫空氣搖床、旋渦混合器、磁力攪拌器、微波爐等。2.器材準(zhǔn)備

⑴將90ml水裝入250ml三角瓶中，并裝有15-20個玻璃珠，滅菌。⑵將9ml水裝入試管，滅菌。

⑶試管架，1ml無菌吸管，記號筆，白瓷比色板，接種環(huán)，酒精燈等。

（四）試驗方法：

1.樣品采集

在靠近植株根系部,去除表層0-5cm的表土，采集5~20cm土壤剖面,多點采集,混勻后四分法取1kg,裝無菌塑料袋帶回，4℃冰箱保存。

2.懸液制備

稱取10g土壤樣品，放入盛有90ml無菌水的三角瓶中，置于搖床上室溫振蕩20min，使土樣與水充分混合，將土壤中的微生物細胞充分分散，從土壤中分開出來。此為10土壤懸液，吸取lml此土壤懸液于9ml無菌水中，另用無菌吸管吹吸3次混勻，制成10-2土壤懸液。以此類推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀釋度的土壤懸液。3.土壤懸液稀釋度選擇⑴細菌:10-4~10-6⑵放線菌：10-3~10-5⑶真菌：10-2~10-4

以上采用稀釋平板法，分別設(shè)置三個濃度梯度，二次重復(fù)。⑷亞硝酸細菌：10-3~10-6

-3-6

⑸硝酸細菌：10~10⑹反硝化細菌：10-4~10-7⑺好氣性自生固氮菌：10-3~10-6⑻氨氧化細菌：10~10

⑼好氣性纖維素分解菌：10-2~10-5以上采用最大或然法（MPN），分別設(shè)置四個濃度梯度，三次重復(fù)。

-5

-8

-1

4.接種

⑴液體培養(yǎng)基

將六種功能菌培養(yǎng)基分裝于試管中，每管5ml，每個菌需培養(yǎng)基12支試管。依照縱3橫4的方陣排列于試管架上，標(biāo)簽示之。

用1ml無菌吸管依次從低濃度到高濃度吸取土壤稀釋液，放入各自對應(yīng)編號的管中。另取一管培養(yǎng)基接種1ml無菌水作為對照。⑵瓊脂培養(yǎng)基

將細菌、放線菌、真菌瓊脂培養(yǎng)基采用混菌法進行接種，每個培養(yǎng)皿接種lml土壤稀釋液，二次重復(fù)。接種后，倒入15-20ml培養(yǎng)基迅速混勻。

5.培養(yǎng)

將所有試管和平板置于25-28℃黑暗條件下避光培養(yǎng)。培養(yǎng)時間由短到長分別為：⑴真菌：2～3d；⑵細菌：3～4d；⑶放線菌：5～7d。

⑷氨氧化細菌：7～8d；

⑸好氣性自生固氮菌：7～8d；⑹亞硝酸細菌：10～14d；⑺硝酸細菌：10～14d；⑻反硝化細菌：10～14d；

⑼好氣性纖維素分解菌：10～14d；

6.結(jié)果觀測

⑴亞硝酸細菌：取出培養(yǎng)液5滴于白瓷比色板上，參與格里斯試劑（GriessReagent）第一、其次液各兩滴，如有亞硝酸鹽存在，則呈紅色。

⑵硝酸細菌：取出培養(yǎng)液5滴于白瓷比色板上，參與格里斯試劑（GriessReagent）第一、其次液各兩滴，如不呈紅色，表示亞硝酸均已經(jīng)完全消失。此時，另取培養(yǎng)液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺試劑2滴，如呈藍色，則表示亞硝酸已經(jīng)被氧化成硝酸，說