流感病毒的收獲及效第1頁/共20頁

第一部分流感病毒的收獲

實驗目的

掌握從雞胚尿囊腔收獲流感病毒的方法，獲得大量的病毒抗原。

第2頁/共20頁實驗原理

將流感病毒接種于雞胚尿囊腔后，病毒就在尿囊的內胚層細胞繁殖，繁殖1~2天后，病毒顆粒釋放至尿囊液中，從而使尿囊腔中含有大量病毒，通過收獲尿囊液，

可以得到較大量的流感病毒。第3頁/共20頁實驗材料及器械1.已接種流感病毒的十日齡雞胚

2.無菌鑷子、眼科剪刀、玻璃吸管、無菌EP管（1.5和10mL各一個）

3.75％酒精棉球第4頁/共20頁實驗方法與步驟收獲時間根據(jù)不同的病毒而異，流感病毒一般培養(yǎng)36～48小時即可進行收獲。收獲前一天晚上，將雞胚于4℃冰箱過夜（如果急于收獲亦可于－20℃放置1小時左右），將雞胚凍死，使紅血球凝固，這樣可避免在收獲時流出的血細胞，同尿液或羊水里的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度的下降。第5頁/共20頁4℃冷藏時間不宜過長，過長易造成散黃，影響收獲?？焖倮鋬鰰r間也不易過長，一旦雞胚凍成冰塊就無法收獲。2.經(jīng)過冰凍的雞胚用碘酒、75％酒精消毒雞胚氣室部卵殼第6頁/共20頁3.用無菌鑷子將消毒過的殼打碎，輕輕揭去氣室部位卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，并將雞胚輕輕推向一側，壓住。4.用無菌吸管通過絨毛尿囊膜進入尿囊腔吸出尿囊液（無大血管處輕輕吸取清亮的黃色液體）。收取的尿囊液可無菌小瓶第7頁/共20頁第二部分血細胞凝集實驗測定流感病毒效價

實驗目的掌握血凝試驗的方法和原理，了解流感病毒具有凝集雞紅細胞的能力，掌握病毒類型的測定的一種方法。第8頁/共20頁第9頁/共20頁第10頁/共20頁血凝原理血凝抑制原理第11頁/共20頁實驗材料及器械1.收獲的尿囊液（即流感病毒）2.1%雞紅血球、0.85％生理鹽水3.血凝板、吸管、三角瓶第12頁/共20頁實驗方法及步驟1.第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加入0.1ml尿囊液。2.吸取0.9ml生理鹽水于血凝板第2孔，從第3孔至第10孔每孔各加生理鹽水0.4ml。3.反復吹打3～4次第2孔，從混勻的第2孔中丟棄0.2ml，吸取0.4ml至第3孔混勻，再吸0.4ml至第4孔，依次稀釋到第9孔，第9孔經(jīng)稀釋吹打后吸出0.4ml，第13頁/共20頁

棄去，第10孔為血球對照，即不加尿囊液。以上各孔（從第1孔到第10孔）的病毒的稀釋度分別為：孔數(shù)12345678910稀釋度病毒原液1：101：201：401：801：1601：3201：6401：1280空白對照注意：各孔內液體量應為0.4ml第14頁/共20頁4.從第10孔開始，按10-1的方向，向每孔加0.4ml1％雞紅血球，輕輕振蕩均勻，置室溫45分鐘后觀察實驗結果并記錄，各孔的總體積應為0.8ml。

12345678910病毒原液紅細胞對照

依次加入0.4ml1％雞紅血球第15頁/共20頁實驗結果判斷

血凝結果以++++、+++、++、+、－表示。紅細胞均勻分布于孔底者為++++；紅細胞均勻分布于孔底，但有卷邊現(xiàn)象為+++，即不完全凝集；紅細胞在孔底形成一個中等大小環(huán)狀，四周和中心有凝集以兩個加號++表示。紅細胞在孔底形成一個小團，邊緣光滑圓潤者為－，紅細胞完全未被凝集；第16頁/共20頁第17頁/共20頁實驗中應注意的一些問題1.實驗所使用的玻璃器材及有機玻璃板均應干凈，血凝板使用完畢及時處理，避免殘留的酸、堿和沉著的紅細胞影響實驗結果

2.流感病毒是對溫度比較敏感的病毒，標本置于－20℃時在一兩個星期內會出現(xiàn)病毒效價減少的現(xiàn)象，一般需要在－70℃存放。

3.一般采取公雞的紅細胞，而且存放時間超過一周就不可再用。紅細胞采來后用PBS洗3到4遍，直到上清很清亮，放置后如果上清變紅，說明有溶血，則不可再用。第18頁/共20頁