細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件第1頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件細(xì)胞的營養(yǎng)需要細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓無污染無毒第2頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及設(shè)備器材1.細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)原則及要求◆保證無微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影響具體工作：器皿洗刷試劑和培養(yǎng)液的配制制備細(xì)胞孵育細(xì)胞傳代細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸?shù)?頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二◆必須樹立無菌觀念，堅(jiān)持一貫的無菌操作，進(jìn)行無菌處理?！魧?shí)驗(yàn)室應(yīng)分為無菌室、準(zhǔn)備室和洗刷消毒室，除洗刷消毒室須分隔開外，無菌室和準(zhǔn)備室可在同一房間內(nèi)，但需劃分出不同功能區(qū)，即無菌操作區(qū)和培養(yǎng)、觀察區(qū)。無菌觀念第4頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二1）無菌室◆為無菌操作而設(shè)計(jì)的空間，包括操作間和緩沖間?！舨僮鏖g又可分為細(xì)胞室和感染室◆緩沖間能保護(hù)無菌間的無菌環(huán)境，可兼有更換無菌衣帽和進(jìn)行一些簡單操作（如放孵育箱、離心等）的功能?！粽麄€(gè)面積約10m2，通入經(jīng)濾過的無菌空氣，與周圍實(shí)驗(yàn)室比較應(yīng)保持正壓，常備紫外燈，室內(nèi)其他陳設(shè)盡量減少。第5頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二

無菌室結(jié)構(gòu)模式圖back

第6頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二使用無菌室時(shí)應(yīng)按以下順序：①熟悉實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，背鰭必要的材料和器具，杜絕試驗(yàn)過程中反復(fù)出入無菌室。②傳戴無菌衣帽和口罩。③關(guān)閉殺菌燈，通過一定路線拿如必要物品（應(yīng)盡量減少出入的次數(shù)）。④手部消毒后再進(jìn)行操作。⑤完成實(shí)驗(yàn)后將用完的物品移出室外。⑥擦凈實(shí)驗(yàn)臺，退出后打開滅菌燈。第7頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二☆每日（使用前）紫外照射（1－2小時(shí)），☆每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）☆每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒?！顚?shí)際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。無菌室的維護(hù)第8頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二☆注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進(jìn)出無菌室時(shí)，能使外界空氣直接對流進(jìn)無菌室的操作間；等。

第9頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2）超凈工作臺（凈化工作臺）比較密閉，分垂直流和側(cè)流式，外界空氣通過濾器從上面、側(cè)面或正面流入操作箱內(nèi)，并能形成氣流屏障，以保持臺面無菌。超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

第10頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二超凈臺的使用與保養(yǎng)：★平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜★使用前最好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；★使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺第11頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二無菌工作臺操作布局示意圖第12頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3）無菌箱第13頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（1）大型設(shè)備工具類

①無菌室、實(shí)驗(yàn)室、超凈工作臺、無菌操作箱等②二氧化碳（CO2）孵箱、恒溫孵箱、試管架2.設(shè)備器材第14頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。第15頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二倒置顯微鏡③倒置顯微鏡、普通顯微鏡、實(shí)體解剖顯微鏡及照相系統(tǒng)第16頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二④高速離心機(jī)（水平式500～4000r/min）⑤普通、低溫冰箱及液氮裝置⑥藥品柜、器械柜、實(shí)驗(yàn)臺等第17頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（2）消毒滅菌設(shè)備①高壓蒸汽滅菌器②干熱滅菌器③濾過器（蔡氏濾器、微量超濾膜濾器等）④紫外燈、離子發(fā)生器⑤耐酸耐高溫容器、吸管自動沖洗器、玻璃器皿清洗箱第18頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（3）配液用具①蒸餾水制作系統(tǒng)、陰離子交換樹脂裝置。②天平稱量系統(tǒng)。③pH儀或試紙（精密）④量筒、漏斗、溶量瓶、磁力攪拌器等第19頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（4）制備、培養(yǎng)、保存細(xì)胞用品①刀、剪、鑷等解剖用具，80～200目尼隆網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板②培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)管、培養(yǎng)板（4、6、12、24、48、96孔）、離心管③吸管、滴管、吹打管、試管④500ml、250ml、100ml、50ml等溶液瓶⑤渦流混勻器、恒溫磁力攪拌器、恒溫水浴鍋等⑥細(xì)胞凍存管等第20頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二第21頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)板第22頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)瓶第23頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二酶標(biāo)儀微孔板震蕩器第24頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二二、實(shí)驗(yàn)器材的處理防止微生物污染和細(xì)胞污染1.清洗1）玻璃器皿的清洗（1）浸泡★新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，★然后用5％鹽酸浸泡過夜；★用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。第25頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二★注意讓水灌滿瓶皿，以利充分浸泡、沖洗?！镉形廴镜钠髅蟊仨毾认緶缇笤俳?、沖洗。（2）刷洗★軟毛刷★優(yōu)質(zhì)洗滌劑或?qū)Ｓ孟礈靹镙p刷，不宜刷洗次數(shù)太多第26頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（3）浸酸◆器皿干燥后浸酸◆器皿內(nèi)要充滿清潔液，勿留氣泡◆注意安全◆浸清潔液處理后的器皿必須徹底沖洗（4）沖洗◆自來水流水沖洗◆蒸餾水沖洗3遍第27頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二清潔液配制注意事項(xiàng)①選用耐酸塑料桶或不銹鋼桶配置為宜⑤清潔液腐蝕性極強(qiáng)，配置與應(yīng)用時(shí)必須小心，做好防護(hù)④清潔液配好后呈棕紅色，帶邊綠色是標(biāo)明失效③緩緩加入濃硫酸，切忌過急，否則將大量產(chǎn)熱而發(fā)生危險(xiǎn)（決不可將重鉻酸鉀液倒入濃硫酸中）②先將重鉻酸鉀溶于水中（用玻璃棒攪拌助溶，有時(shí)不能完全溶解）第28頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二清洗示意圖白箭頭：玻璃制品黑箭頭：橡膠制品

back第29頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2）塑料器皿沖洗流水沖洗晾干后包裝，以備滅菌蒸餾水漂洗3次2％～5％鹽酸浸泡30min自來水沖洗2％氫氧化鈉（NaOH）浸泡過夜晾干自來水沖洗第30頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3）膠塞等橡膠類用品的處理自來水沖洗2％氫氧化鈉（NaOH）煮沸15min2％～5％鹽酸煮沸15min蒸餾水漂洗5次以上晾干后包裝自來水沖洗自來水沖洗5次以上蒸餾水煮沸10min烘干備用高壓滅菌第31頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二4）金屬器械的清洗新的先用沾有汽油的紗布擦去油脂再用水洗凈最后用乙醇棉球擦拭，晾干用過的先以清水煮沸消毒，再擦拭干凈使用前以蒸餾水煮沸10分鐘，或包裝好后101.3kPa高壓滅菌15分鐘第32頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二5）除菌濾器的處理2、包裝目的：防止消毒滅菌后再次遭受污染包裝材料：包裝類型：常用的包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙或棉線繩局部包裝全包裝第33頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3、消毒滅菌1.干烤7.抗生素消毒滅菌6.熏蒸消毒5.射線4.紫外線2.高壓蒸汽滅菌3.濾過滅菌第34頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二第35頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二消毒劑類別名稱濃度(%)用途重金屬鹽紅汞2皮膚、粘膜、小創(chuàng)面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化劑高錳酸鉀0.1皮膚、尿道、水果、蔬菜消毒過氧化氫3皮膚、粘膜、創(chuàng)傷消毒過氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纖維消毒鹵素類碘液2.5皮膚消毒醇類乙醇70～75皮膚、體溫計(jì)消毒酚類石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒來蘇3～5同上、也常用于手及皮膚消毒表面活性劑新潔爾滅0.1手術(shù)器械消毒酸堿類生石灰1:4～1:8排泄物、地面消毒染料龍膽紫2～4表淺創(chuàng)傷消毒8.化學(xué)消毒劑第36頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二三、培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）天然培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液第37頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二1.細(xì)胞培養(yǎng)對水的要求純化水蒸餾水（三蒸水）存放時(shí)間最好不要超過2周（一）離子交換裝置（二）蒸餾水裝置第38頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2.平衡鹽溶液主要成分：無機(jī)鹽葡萄糖酚紅：指示劑常用的BSS種類：（一）Hanks液（三）PBS液（二）Earle液第39頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二BSS的配制要求：①要防止鈣的沉淀②要有良好的緩沖作用主要用途：①作為配制培養(yǎng)液的基礎(chǔ)溶液②配制各種試劑③用于洗滌組織和細(xì)胞第40頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二水：新鮮配置的三蒸水或去離子水1.pH7.2PBS貯備液（10×）配法

NaCl8.5gKCl0.2gNa2HPO4﹒12H2O2.85gKH2PO40.27g

溶于100ml雙蒸水中2.PBS使用液配法貯備液50ml

雙蒸水450ml細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制第41頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二成分RingerPBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl(g)8.008.006.808.008.008.00KCl(g)0.420.200.400.400.200.40CaCl(g)0.25

0.200.140.10

MgCL·6H2O(g)

0.10

MgSO4·7H2O(g)

0.200.20

Na2HPO4·H2O(g)

1.56

0.06

0.06NaH2PO4·2H2O(g)

0.14

1.42

KH2PO4(g)

0.20

0.060.200.06NaHPO4(g)

2.200.35

0.35葡萄糖(g)

1.001.00

酚紅(g)

0.020.020.020.02幾種常用的BSS配方（g/L）第42頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3.細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑1）細(xì)胞分離液（消化液）：胰蛋白酶依地酸二鈉（disodiumedetate,EDTA-2Na）膠原酶常用的消化液：第43頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二

◆胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離?！粢鹊鞍酌敢簼舛仍礁撸饔迷綇?qiáng)，但超過一定限度會損傷細(xì)胞?！粢鹊鞍酌甘且环N黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。（1）胰蛋白酶第44頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二◆蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘?！糇钸m作用條件為pH8.0、37℃◆用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用第45頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（2）EDTA(0.01-0.02%)◆一種化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versene液◆對細(xì)胞有一定的解離作用◆毒性小，價(jià)格低廉，使用方便第46頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（3）胰酶-EDTA◆分散細(xì)胞效力好◆濃度分別為0.25和0.02%◆

-20℃保存，不易反復(fù)凍融第47頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（4）膠原酶(1-5mg/ml)◆從溶組織芽孢梭菌等細(xì)菌的培養(yǎng)液中分離得到的一組對膠原蛋白有較強(qiáng)水解作用的酶?！裟z原蛋白富含甘氨酸、羥脯氨酸，普通的蛋白水解酶對其的水解能力弱?！舴N類多，不同生化試劑公司的產(chǎn)品種類、純度、酶活性都有一定差異?！粢话闩涑?0×貯備液，使用前作10倍稀釋第48頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2）pH調(diào)整液◆細(xì)胞生長的最適pH為7.0～7.2，可耐受的pH范圍是6.6～7.8?！艉铣膳囵B(yǎng)液大多呈弱酸◆常用的調(diào)正液NaHCO2；7.4%，5.6％，3.7％HEPES:10-50mmol/L1NHCL10%HAC1NNaOH第49頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二◆細(xì)胞培養(yǎng)液PH濃度的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因?yàn)镹aHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)，◆羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對細(xì)胞無毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動的特性而用于開放細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，其最大優(yōu)點(diǎn)是在開放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的PH值。第50頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二◆二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值?！舸蠖鄶?shù)細(xì)胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。有資料顯示，原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)PH6.8時(shí)最適。第51頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3）抗菌素溶液：◆在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長?！舫Ｓ糜星嗝顾亍㈡溍顾?、卡那霉素、慶大霉素、兩性霉素B等，常聯(lián)合使用。◆常配成100×或200×濃度，分裝，冷凍保存，使用前加入培養(yǎng)液中。第52頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二抗生素液鏈霉素(100ug/ml)

青霉素(100單位/ml)

制霉菌素(100單位/ml)

終濃度不超過萬分之一為宜第53頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二抗生素濃度(量/ml）抗菌范圍貯存使用真菌細(xì)菌支原體青霉素G10000u100u＋＋＋＋＋＋鏈霉素10000μg100μg＋＋＋慶大霉素10000u50u＋＋卡那霉素5000μg50μg＋＋＋多粘菌素5000μg50μg＋＋四環(huán)素1000μg10μg＋＋＋＋紅霉素5000μg50μg＋＋兩性霉素B500μg5μg＋＋＋＋制菌霉素5000u25μg＋＋＋＋金霉素10000μg50μg

＋＋＋＋抗生素用量和抗菌范圍第54頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二4）L-Glutamin溶液◆制備時(shí)取L-Glutamin（分子量146.15）6g，溶于三蒸水200ml中，濾過除菌，分裝，－20℃冰凍保存◆每100ml培養(yǎng)液中加1mlL-Glutamin溶液第55頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二4.常用培養(yǎng)基◆培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，◆按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；◆按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。第56頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二天然培養(yǎng)基（naturalmedia)：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限，成分復(fù)雜，個(gè)體差異大影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染第57頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（1）雞血漿的制備血漿含有纖維蛋白和一些營養(yǎng)成分，與雞胚胎汁混合會發(fā)生凝固，構(gòu)成組織細(xì)胞生長的環(huán)境，有利于細(xì)胞向三維空間生長。制備為選擇1年左右體大、健壯的雄雞，禁食1天，從雞翅取血，混勻離心取上清，分裝，－20℃保存第58頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分（2）血清第59頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長一般需加10％血清．對于血清支持細(xì)胞生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。第60頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌第61頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3.水解乳蛋白（Lactalbuminhydrolysate,LH）4.鼠尾膠原膠原是細(xì)胞生長的良好基質(zhì)，尤其對組織塊和細(xì)胞的固定附著、改善生長表面的特性有很好的作用。主要用