激光細(xì)胞融合術(shù)第1頁/共65頁激光細(xì)胞融合術(shù)第2頁/共65頁

研究目的和意義發(fā)展歷史討論與分析主要特點應(yīng)用主要內(nèi)容第3頁/共65頁1.細(xì)胞融合的目的和意義細(xì)胞融合是指利用化學(xué)或物理方法把兩個或多個緊連的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的技術(shù)，也稱為體細(xì)胞雜交，是細(xì)胞工程的重要內(nèi)容之一，是一種在細(xì)胞水平上的遺傳操縱。細(xì)胞融合有別于將一個細(xì)胞的細(xì)胞核移入同種或異種去核成熟卵內(nèi)的核移植技術(shù)。第4頁/共65頁細(xì)胞融合的目的和意義

細(xì)胞融合能把親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，甚至毫無親緣關(guān)系的生物體細(xì)胞融合在一起，為遠(yuǎn)緣雜交架起了橋梁，是改善細(xì)胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。第5頁/共65頁融合方法病毒融合法聚乙二醇（PEG）法電融合法微束激光融合法第6頁/共65頁病毒融合法第7頁/共65頁一般過程第8頁/共65頁聚乙二醇（PEG）法

第9頁/共65頁一般過程一般是用人工的方法，即利用各種融合劑如：仙臺病毒或聚乙二醇(PEG)等，把兩個鄰接的細(xì)胞界膜溶解掉，使二個或二個以上的細(xì)胞合并成一個細(xì)胞。最初兩個細(xì)胞只有胞漿合在一起，核各自獨立，這種細(xì)胞叫異型核合胞體。經(jīng)過培養(yǎng)，通過有絲分裂兩種親細(xì)胞的染色體才彼此混合在一起，分到兩個子細(xì)胞核里去，再經(jīng)過胞漿的分裂，變成兩個單核雜交細(xì)胞(見圖)。第10頁/共65頁電氣穿孔法細(xì)胞融合第11頁/共65頁細(xì)胞在融合過程中的主要變化：呈致密狀態(tài)的體細(xì)胞在促融合劑的作用下，細(xì)胞膜的性質(zhì)發(fā)生變化；首先，出現(xiàn)細(xì)胞凝集現(xiàn)象；

然后，部分凝集細(xì)胞之間的膜發(fā)生粘連；繼而，融合形成多核細(xì)胞；第12頁/共65頁細(xì)胞在融合過程中的主要變化：在培養(yǎng)過程中多核細(xì)胞又進行核的融合而成為單核的雜種細(xì)胞而那些不能形成單核的融合細(xì)胞在培養(yǎng)過程中逐漸死亡。第13頁/共65頁融合結(jié)果細(xì)胞融合的結(jié)果是一個細(xì)胞含有兩個或多個細(xì)胞核，這細(xì)胞稱為多核體。如果細(xì)胞中所含有的核,只來自一種親本型，就稱為同核體。如果細(xì)胞中所含有的核,來自兩種親本型，就稱為異核體。第14頁/共65頁以往方法的缺點以前建立的各種病毒、化學(xué)融合的方法，無法實現(xiàn)所選定的細(xì)胞間的特異融合，且化學(xué)融合劑有毒，需要用紫外光消毒。第15頁/共65頁以往方法的缺點電融合技術(shù)把細(xì)胞聚集接觸和膜結(jié)構(gòu)擾動及融合分為兩步，使特異性融合成為可能。但由于電脈沖的特異性，因此，特異性只能發(fā)生在細(xì)胞聚集時，使這種特異造成的膜的可逆擊穿不具有選擇性，特異性受到很大的約束，且電融法易造成細(xì)胞損傷，影響合成細(xì)胞的融合。第16頁/共65頁以往方法的缺點因此，激光細(xì)胞融合法應(yīng)運而生，它避免了上述兩種方法的缺點。

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激光細(xì)胞融合法（定義）

激光細(xì)胞融合技術(shù)是采用高峰值密度的激光對兩細(xì)胞接觸處的質(zhì)膜進行輻照，質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，可產(chǎn)生微米數(shù)量級的微孔。由于質(zhì)膜的微孔是可逆的，質(zhì)膜分子在重組過程中借助細(xì)胞連接表面的高張力（小孔表面的曲率很大），細(xì)胞逐漸從啞鈴壯變?yōu)閳A球狀，兩個細(xì)胞就融合了。第18頁/共65頁2.發(fā)展歷史早在1838年Muller在腫瘤組織切片中就觀察到細(xì)胞融合的現(xiàn)象，以后陸續(xù)有人報道。但從1838—1958這一時期，人們只對這種自然存在的細(xì)胞融合現(xiàn)象進行描述和推測。第19頁/共65頁發(fā)展歷史自從1958年岡田善雄在偶然的機會中發(fā)現(xiàn)了仙臺病毒能誘導(dǎo)小鼠腹腔艾氏腹水癌細(xì)胞融合，繼而做了一系列工作，因而為體外誘導(dǎo)細(xì)胞融合打下方法學(xué)基礎(chǔ)。第20頁/共65頁發(fā)展歷史1965年Harris＆Watkin在此基礎(chǔ)上利用紫外線滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)不同種動物的細(xì)胞融合成功，并證明這種融合細(xì)胞能存活。同時Letterfield又利用二種具有不同酶缺陷的細(xì)胞融合，并用選擇培養(yǎng)基成功地選出雜交細(xì)胞，因此細(xì)胞融合的試驗性工作才開始蓬勃發(fā)展。第21頁/共65頁發(fā)展歷史1973年童第周教授把此技術(shù)引進我國，并利用大鼠瓦克肉瘤細(xì)胞與雞紅血球的雜交細(xì)胞，開展了腫瘤免疫實驗。第22頁/共65頁發(fā)展歷史1987年聯(lián)邦德國海得堡理化研究所首次報道用激光法誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞融合和植物原生質(zhì)融合。1990年我國張聞迪用激光微束誘導(dǎo)動物卵細(xì)胞融合成功。1992年卜宗式用激光微束誘導(dǎo)金盞菊原生質(zhì)體融合，獲初步成功

第23頁/共65頁發(fā)展歷史在短短的十幾年里，細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展迅猛異常，現(xiàn)在不但可以用種內(nèi)、種間、屬間，甚至動植物細(xì)胞之間也可以融合。此外還可以用人工細(xì)胞進行融合，因而為細(xì)胞重組和細(xì)胞工程開劈了廣闊的研究領(lǐng)域。第24頁/共65頁3.討論與分析

3.1定義細(xì)胞融合實際上是以某種手段改變兩個細(xì)胞接觸處質(zhì)膜的通透性，使兩個細(xì)胞的內(nèi)含物相互混合而成為一個細(xì)胞的過程。激光細(xì)胞融合就是利用激光微束對相鄰的細(xì)胞膜進行破壞（或擾動）來誘導(dǎo)細(xì)胞融合。第25頁/共65頁激光細(xì)胞融合激光細(xì)胞融合技術(shù)是采用高峰值密度的激光對兩細(xì)胞接觸處的質(zhì)膜進行輻照，質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，可產(chǎn)生微米數(shù)量級的微孔。由于質(zhì)膜的微孔是可逆的，質(zhì)膜分子在重組過程中借助細(xì)胞連接表面的高張力（小孔表面的曲率很大），細(xì)胞逐漸從啞鈴壯變?yōu)閳A球狀，兩個細(xì)胞就融合了。

第26頁/共65頁激光細(xì)胞融合將激光光束通過光學(xué)系統(tǒng)加以聚焦，形成非常細(xì)的光束，稱為激光微束。激光微束的光斑直徑小至幾微米或1微米以下。在理論上，光斑直徑可以小到波長的一半。第27頁/共65頁3.2微束激光細(xì)胞融合兩個主要問題:3.2.1激光照射的最佳條件確定問題，如激光波長、單脈沖能量和脈沖個數(shù)的選擇問題。3.2.2細(xì)胞質(zhì)膜的光擊穿問題。即如何得到可自行愈合的所謂“可逆性”微孔，細(xì)胞膜穿孔機制的研究等問題。第28頁/共65頁波長的選擇問題由于不同生物細(xì)胞、質(zhì)膜的脂質(zhì)數(shù)量和脂類的組成雖有較大的差異，但其基本組成與人的紅血細(xì)胞的脂質(zhì)相同。從人的紅血細(xì)胞膜及其脂質(zhì)的吸收光譜，如圖2-1和圖2-2示。第29頁/共65頁波長的選擇問題第30頁/共65頁波長的選擇問題可以看出激光波長在300nm-900nm范圍內(nèi)，紅血細(xì)胞膜及其膜質(zhì)無明顯吸收峰。遠(yuǎn)紫外光對細(xì)胞有較強的致死作用，故不采用。所以可采用300nm-900nm的激光照射細(xì)胞，據(jù)實驗的具體要求對波長進行選擇。第31頁/共65頁單脈沖能量和照射激光脈沖數(shù)與細(xì)胞融合的關(guān)系為了確定單脈沖能量和照射激光脈沖數(shù)與細(xì)胞融合的關(guān)系，佐藤俊一采用波長為355nm,脈寬為17ns，脈沖重復(fù)頻率為100HZ的染料激光器。以鼠骨髓瘤細(xì)胞為材料，作了研究,其結(jié)果如下兩圖示。第32頁/共65頁

由圖2-3可知，脈沖能量達(dá)1.5uJ時，融合率上升到約50%，但超過此能量時反而降低，因為單脈沖能量過高時，照射激光的細(xì)胞對被分離破壞的增多，導(dǎo)致融合率下降。

第33頁/共65頁由圖2-4可知，當(dāng)脈沖為30個時，融合率最高。但如在融合后繼續(xù)照射，會使細(xì)胞損傷、被破壞，導(dǎo)致融合率下降，所以對于鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的最佳單脈沖能量和照射脈沖個數(shù)是1.5uJ和30個脈沖。第34頁/共65頁3.2.2細(xì)胞質(zhì)膜的光擊穿問題據(jù)現(xiàn)代理論:細(xì)胞膜多采用液體鑲嵌(fluidmosaicmodel)模型，這是個動態(tài)模型，認(rèn)為細(xì)胞膜是由脂質(zhì)雙分子層中鑲嵌著球蛋白質(zhì)分子，按二維排列的液狀體組成的。膜的雙分子層具有流動性，蛋白質(zhì)分子在膜中的分布是不對稱的。它的模型如下圖示。第35頁/共65頁第36頁/共65頁3.2.2細(xì)胞質(zhì)膜的光擊穿問題關(guān)于細(xì)胞膜的擊穿問題，有人認(rèn)為激光脈沖作用時間短、熱效應(yīng)小、沖擊效應(yīng)大,這時膜孔可閉合。有的學(xué)者則認(rèn)為激光微束照射在細(xì)胞壁上，光壓效應(yīng)小，不足以使細(xì)胞壁穿孔；產(chǎn)生穿孔是一種熱效應(yīng)。第37頁/共65頁細(xì)胞質(zhì)膜的光擊穿問題膜吸收光子產(chǎn)生熱效應(yīng)，這種熱效應(yīng)不會造成照射點周圍的熱損傷。如激光脈寬為5ns，時間短、熱量未能及時擴散到周圍環(huán)境，照射點溫度由升到,最后到達(dá)，然后溫度逐漸地由降低到、、第38頁/共65頁3.2.2細(xì)胞質(zhì)膜的光擊穿問題可見激光微束不會在照射點周圍引起熱損傷。仍能保持細(xì)胞的正常生理、生化特性，不影響細(xì)胞的存活第39頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔激光作用于細(xì)胞膜上，產(chǎn)生可逆性微孔，到底是熱效應(yīng)為主，還是光壓效應(yīng)為主？針對這一問題，沈子威教授又利用掃描電子顯微鏡(SEM)進一步研究了激光微束作用于細(xì)胞膜上產(chǎn)生可恢復(fù)性小孔的形成機理，認(rèn)為膜的變化主要是由光壓造成的。

第40頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔實驗發(fā)現(xiàn)：對不同生物的細(xì)胞膜，所需穿孔的激光微束能量不同，與膜種類、厚度、膜的彈性強度有關(guān)。一般植物細(xì)胞所需能量比動物細(xì)胞要大。對動物卵細(xì)胞(如蛙卵、魚卵等)，因卵膜厚且富有彈性，實驗中要用很強的激光束能量刁能穿孔。能量不夠強，則只能使卵膜產(chǎn)生局部凹陷，而不能擊穿。這說明激光微束產(chǎn)生的光壓效應(yīng)確實對細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆性穿孔起主要作用。第41頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔對這種光壓造成的可恢復(fù)性“小孔”，從分子模型上分析，是由于光壓作用給磷脂層一個沖擊力，將其在某處斷開，斷開瞬間，脂膜流動性使磷脂分子在沖擊處向兩側(cè)擠靠，從而使孔邊緣處磷脂側(cè)向排列趨向緊密，由于脂質(zhì)的兩性特性，它重新排列如圖2-7所示。這時膜處于“亞穩(wěn)態(tài)”。從上方俯視膜孔，如圖2-8所示。

第42頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔第43頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔此時激光脈沖過后，膜仍具有一定的流動性，磷脂分子會逐漸恢復(fù)到天然膜的原始狀態(tài)一恒穩(wěn)態(tài)。激光微束在細(xì)胞膜上產(chǎn)生的可逆性小孔，是微米量級的，如微孔孔洞過大，則它不再是可逆性的了，說明它對細(xì)胞造成了永久性損傷。第44頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔綜上所述，如是產(chǎn)生了可逆性小孔，則主要是由光壓造成的，由熱效應(yīng)產(chǎn)生的膜擊穿，一般是不可逆的，當(dāng)然如光壓過大，造成孔洞過大，則孔洞也是不可逆的。第45頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔如用激光照射在兩接觸的細(xì)胞膜，在兩細(xì)胞膜上均產(chǎn)生了可逆性的，微米量級的微孔，那這時兩細(xì)胞膜將如何發(fā)展呢?這時質(zhì)膜分子在重組過程中，由于范德瓦爾斯力作用而聚集排列、形成分子連接橋，細(xì)胞連接處膜的表面曲率很高，張力大，細(xì)胞就逐漸由啞鈴狀變?yōu)閳A球狀，細(xì)胞融合起來。第46頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔另外，由于脂質(zhì)的兩性特性，即它具有親水性頭基以及厭水性的尾端—通常是脂肪酸鏈。所以細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層具有自行組合，自行修補的功能。這就是微束激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機理。微束激光細(xì)胞融合實際上是利用微束激光改變兩個細(xì)胞接觸處細(xì)胞膜的通透性，使兩個細(xì)胞的內(nèi)含物混合成一個細(xì)胞的過程。

第47頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔第48頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔第49頁/共65頁如何得到“可逆性”微孔第50頁/共65頁4.激光細(xì)胞融合的特點①易于實現(xiàn)特異性細(xì)胞融合。②定時、定位性強,可選擇任意兩個細(xì)胞，可非接觸，安全，遠(yuǎn)距離操作，可實時觀察。③是一種無毒的，損傷很小的，甚至可實現(xiàn)無損傷的融合方法。④實現(xiàn)了裝置化，智能化操作方便第51頁/共65頁4.激光細(xì)胞融合的特點⑤實驗參數(shù)易于控制，重復(fù)性較好，融合機理較清楚，便于開展定量研究而其他方法存在重復(fù)性差、經(jīng)驗性大、影響因素多、融合率不穩(wěn)定、融合機理不清楚等問題。⑥缺點：只能逐一處理細(xì)胞，不能象其他方法一樣同時處理大量細(xì)胞。另外它的設(shè)備相對昂貴些。第52頁/共65頁5.應(yīng)用

動物體細(xì)胞雜交技術(shù)主要應(yīng)用基因定位和繪制人類基因圖譜生產(chǎn)樹突狀細(xì)胞抗腫瘤疫苗生產(chǎn)單克隆抗體動物育種細(xì)胞療法第53頁/共65頁單克隆抗體備置第54頁/共65頁在基礎(chǔ)理論研究方面的應(yīng)用研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系和個體發(fā)育

揭示疾病發(fā)生的機制

膜蛋白動力學(xué)研究第55頁/共65頁植物細(xì)胞融合技術(shù)通過植物細(xì)胞融合培育抗病新材料；合成新的物種；轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)基因。第56頁/共65頁植物細(xì)胞融合技術(shù)植物細(xì)胞融合技術(shù)目前主要是作為擴大變異的手段，同時也正朝著將抗藥性和胞質(zhì)雄性不育等細(xì)胞質(zhì)基因?qū)肓硪粋€體細(xì)胞的方向發(fā)展，有可能形成新的核質(zhì)雜種。第57頁/共65頁植