生化提高的課件資料第1頁/共53頁

考點(diǎn)：1.核酸的分子組成；2.DNA的一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)及其功能；3.幾種主要RNA(mRNA、tRNA)的結(jié)構(gòu)與功能；4.DNA的理化性質(zhì)及應(yīng)用。

重點(diǎn)：DNA的二級結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)；DNA的變性復(fù)性特點(diǎn)及此特點(diǎn)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用。

第2頁/共52頁第2頁/共53頁基本知識與理論第3頁/共52頁第3頁/共53頁一、核酸的化學(xué)組成

核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子。包括兩類：一類為脫氧核糖核酸（DNA），另一類為核糖核酸（RNA）。

DNA存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，攜帶遺傳信息；RNA存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，參與細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的表達(dá)。

核酸的基本組成單質(zhì)是核苷酸，而核苷酸又是由堿基、戊糖、磷酸組成。第4頁/共52頁第4頁/共53頁(一)堿基構(gòu)成核苷酸的堿基主要有五種，分屬嘌呤和嘧啶兩類。嘌呤類化合物包括腺嘌呤A和鳥嘌呤G兩種。嘧啶類化合物有三種，胞嘧啶C、胸腺嘧啶T及尿嘧啶U。嘌呤和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵，因此對波長260nm左右的紫外光有較強(qiáng)吸收，這一性質(zhì)可用于對核酸、核苷酸、及堿基進(jìn)行定性定量分析。第5頁/共52頁第5頁/共53頁(二)戊糖與核苷、核苷酸

戊糖是核苷酸的另一個(gè)主要成分。構(gòu)成DNA的核苷酸的戊糖是β-D－2-脫氧核糖，而構(gòu)成RNA的核苷酸的戊糖為β-D核糖。即RNA糖環(huán)上2號碳原子處連的是-OH，而DNA此處連的是-H。第6頁/共52頁第6頁/共53頁

RNA和DNA主要區(qū)別有兩點(diǎn)：構(gòu)成DNA的堿基為A、T、G、C，

而RNA的堿基為A、U、G、C；2.構(gòu)成DNA的核苷酸的戊糖是β-D－2-脫氧核糖，而構(gòu)成DNA的核苷酸的戊糖為β-D－核糖。即RNA糖環(huán)上2號碳原子處連的是-OH，而DNA此處連的是-H。

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表示堿基和糖環(huán)上各原子次序時(shí)，在堿基雜環(huán)上標(biāo)以順序1，2，3…；在糖環(huán)上標(biāo)以l′，2′，3′…以作區(qū)別。

堿基與戊糖通過糖苷鍵連接成核苷。連接位置是C-1′。

核苷與磷酸通過磷酸酯鍵連接成核苷酸，連接位置是C-5′。此處可連接一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)磷酸基團(tuán)，稱為核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。

體內(nèi)還有一種核苷酸，即C-3′與C-5′與同一磷酸基團(tuán)相連，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。

第8頁/共52頁第8頁/共53頁二、DNA的結(jié)構(gòu)與功能DNA與蛋白質(zhì)一樣，也有其一級、二級、三級結(jié)構(gòu)。

（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)指DNA分子中核苷酸的排列順序。由于核苷酸的差異主要表現(xiàn)在堿基上，因此也叫做堿基序列。

四種核苷酸按一定排列順序，通過磷酸二酯鍵連成主要核苷酸鏈，連接都是由前一核苷酸3′-OH與下一核苷酸5′-磷酸基形成3′-5′磷酸二酯鍵，故核苷酸鏈的兩個(gè)末端分別是5′-游離磷酸基和3′-游離羥基，書寫應(yīng)從5′到3′。第9頁/共52頁第9頁/共53頁（二）DNA的二級結(jié)構(gòu)：1.右手雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，要與蛋白質(zhì)的α-螺旋相區(qū)別。（1）Chargaff規(guī)則

DNA分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的含量相等，鳥嘌呤與胞嘧啶的含量相等；因此DNA中嘌呤與嘧啶的總數(shù)相等：即A＋G=C＋T（2）雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

1953年Watson和Crick正式提出了關(guān)于DNA二級結(jié)構(gòu)的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，主要內(nèi)容有：

DNA分子由兩條反向平行的多聚核苷酸鏈圍繞同一中心軸盤曲而成，兩條鏈均為右手螺旋，鏈呈反平行走向，一條走向是5′→3′，另一條是3′→5′。

DNA鏈的骨架由交替出現(xiàn)的親水的脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)，堿基配對位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。兩條多聚核苷酸鏈以堿基之間形成氫鍵配對而相連，即A與T配對，形成兩個(gè)氫鍵，G與C配對，形成三個(gè)氫鍵。堿基相互配對又叫堿基互補(bǔ)。RNA中也有配對區(qū)，A是與U以兩個(gè)氫鍵配對互補(bǔ)。堿基對平面與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基對沿軸轉(zhuǎn)36°，上升0.34nm。每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)含10對堿基，螺旋的螺距為3.4nm，直徑是2.0nm。DNA兩股鏈之間的螺旋形成凹槽：一條淺的，叫小溝；一條深的，叫大溝。大溝是蛋白質(zhì)識別DNA的堿基序列發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)，使蛋白質(zhì)和DNA可結(jié)合而發(fā)生作用。

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵和堿基堆積力維持。堿基堆積力是堿基對之間在垂直方向上的相互作用，可以使DNA分子層層堆積，分子內(nèi)部形成疏水核心，這對DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是很有利的，堿基堆積力對維持DNA的二級結(jié)構(gòu)起主要作用。

口訣：DNA，雙螺旋，正反向，互補(bǔ)鏈。A對T，GC連，配對時(shí)，用氫鍵，AT2，GC3

，十堿基，轉(zhuǎn)一圈，螺距34點(diǎn)中間。堿基力和氫鍵，維持螺旋結(jié)構(gòu)堅(jiān)。（AT2，GC3是指之間二個(gè)氫鍵GC間三個(gè).螺距34點(diǎn)中間即3.4）

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DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)要與pr的相區(qū)別：DNA是兩條核苷酸鏈通過堿基之間氫鍵相連而成，而蛋白質(zhì)的α-螺旋是一條肽鏈自身盤曲而成，其氫鍵是其內(nèi)部第一位肽鍵的N-H與第四個(gè)肽鍵的羰基氧形成的。第11頁/共52頁第11頁/共53頁

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性：

DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA分子在水性環(huán)境和生理?xiàng)l件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但并不是不變的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度或相對濕度時(shí)，DNA結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，除了Waston－Crick模型（B－DNA）外，還存在Z－DNA和A－DNA。

第12頁/共52頁第12頁/共53頁2.DNA的其它二級結(jié)構(gòu)形式（1）三股螺旋DNA

三股螺旋DNA也稱三鏈DNA（triplestrandDNA,tsDNA),其結(jié)構(gòu)是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成。雙螺旋通過Watson-Crick氫鍵穩(wěn)定，而三股螺旋則需通過Hoogsteen氫鍵穩(wěn)定。三條鏈均為同型嘌呤（homopurine,Hpu)或同型嘧淀（homopyrimidine,Hpy),即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。第13頁/共52頁第13頁/共53頁

根據(jù)三鏈的組成和相對位置分為兩種基本類型：嘌呤-嘌呤-嘧啶型（Pu-Pu-Py型)：嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Py-Pu-Py型)：——在堿性介質(zhì)中穩(wěn)定——在偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定

三鏈中的兩條鏈為正常雙螺旋，第三條嘧啶鏈位于雙螺旋的大溝中，并隨雙螺旋結(jié)構(gòu)一起旋轉(zhuǎn)。第14頁/共52頁第14頁/共53頁

三鏈中堿基配對符合Hoogsteen模型：在Py-Pu-Py型中為：T=A=T、C+=G=C（與G形成Hoogsteen鍵的C必須質(zhì)子化）；在Pu-Pu-Py中為：G=G=C、A=A=T第15頁/共52頁第15頁/共53頁

當(dāng)DNA雙鏈中含有H-回文序列時(shí)，即某區(qū)段DNA兩條鏈分別為Hpu和Hpy，并且各自為回文結(jié)構(gòu)時(shí)，任一條回文結(jié)構(gòu)的5’

和3’部分都可以形成分子內(nèi)三股螺旋及剩余的半條回文游離單鏈。在一定條件下，含回文序列DNA還可形成小瘤DNA（noduleDNA),它在中性溶液中穩(wěn)定。第16頁/共52頁第16頁/共53頁

真核生物基因組中存在大量可形成三鏈DNA的多聚嘌呤核苷酸和多聚嘧啶核苷酸序列。這些序列有的存在于調(diào)控區(qū)，有的位于DNA復(fù)制的起點(diǎn)或終點(diǎn)，有的則位于染色體重組位點(diǎn)，提示它們可能與基因的表達(dá)調(diào)控、DNA的復(fù)制及染色體的重組有關(guān)。第17頁/共52頁第17頁/共53頁（2）十字型結(jié)構(gòu)

十字型結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)是DNA分子中存在翻轉(zhuǎn)重復(fù)序列。此時(shí)不僅兩條鏈互補(bǔ)。單鏈中的翻轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)也可以互相配對形成雙鏈分子。

DNA變性后或因其他原因引起DNA分子兩條鏈分開，再復(fù)性時(shí)翻轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)的DNA可以自我配對，形成突出于雙鏈之外的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩個(gè)并列的發(fā)夾形成十字結(jié)構(gòu)。第18頁/共52頁第18頁/共53頁5’

TCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAGGCCGTTTGTTTGTGGGCGACCATCGCCACCAAAAAAACAAACG5’GGTTACGGCCGCGATCGCGATATATTATATAGCGCTAGCGCCGGCATCAC5’---TCCGGCAAACTTTTGTTTGC------AGGCCGTTTGAAAACAAACG---5’

第19頁/共52頁第19頁/共53頁

與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)相比,十字形結(jié)構(gòu)中氫鍵形成減少,而且失去了雙螺旋DNA堿基堆積力的相互作用,因而穩(wěn)定性不如雙螺旋DNA.

十字形結(jié)構(gòu)可能在基因表達(dá)調(diào)控中起作用,但其確切的生物學(xué)功能有待研究.第20頁/共52頁第20頁/共53頁（三）DNA三級結(jié)構(gòu)真核生物DNA分子很大，DNA鏈很長，但卻要存在于小小的細(xì)胞核內(nèi)，因此DNA必須在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上緊密折疊，這就形成了三級結(jié)構(gòu)。1.超螺旋：（1）原核生物DNA的三級結(jié)構(gòu)絕大部分原核生物DNA是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙螺旋分子，此環(huán)形分子可再次螺旋形成超螺旋；（2）真核生物線粒體、葉綠體DNA也為環(huán)形分子，能形成超螺旋，非環(huán)形DNA分子在一定條件下局部也可形成超螺旋。第21頁/共52頁第21頁/共53頁2.真核細(xì)胞基因組DNA

真核細(xì)胞核內(nèi)染色體即是DNA高級結(jié)構(gòu)的主要表現(xiàn)形式。組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成組蛋白八聚體。DNA雙螺旋纏繞其上構(gòu)成核心顆粒，顆粒之間再以DNA和組蛋白H1連成核小體，核小體再經(jīng)多步旋轉(zhuǎn)折疊形成棒狀染色體，存在于細(xì)胞核中。第22頁/共52頁第22頁/共53頁(四)DNA的功能

DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動的基礎(chǔ)。

第23頁/共52頁第23頁/共53頁三、RNA的結(jié)構(gòu)與功能

RNA通常以單鏈形式存在，這與DNA雙鏈形成螺旋不同，但也可以有局部的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)。RNA分子比DNA分子小，它的功能多樣，種類較多，主要有信使RNA、核蛋白體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、小核RNA及核不均一RNA等。各類RNA在遺傳信息表達(dá)為氨基酸序列過程中發(fā)揮不同的作用。

第24頁/共52頁第24頁/共53頁（一）信使RNA（mRNA）1、真核生物mRNA的一般結(jié)構(gòu)：在細(xì)胞核內(nèi)以DNA單鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成hnRNA，hnRNA經(jīng)過剪切變?yōu)槌墒斓膍RNA,出核后在胞質(zhì)內(nèi)為蛋白質(zhì)合成提供模板。成熟mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）具有5′端帽子結(jié)構(gòu)即在5′端加上一個(gè)7-甲基鳥苷；且原第一個(gè)核苷酸C２′也是甲基化，這種m7GpppN即為帽子結(jié)構(gòu)。（2）3′端多聚腺苷酸尾在mRNA3′端有一段多聚腺苷酸節(jié)段，是在轉(zhuǎn)錄后切掉一段多余的RNA后逐個(gè)添加上去的，這個(gè)多聚尾可能與mRNA從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。第25頁/共52頁第25頁/共53頁2、原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)

原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞顯著不同：5‘端無帽狀結(jié)構(gòu)3‘端不含polyA結(jié)構(gòu)一般為多順反子結(jié)構(gòu)，即一個(gè)mRNA中常含有幾個(gè)蛋白質(zhì)信息，能指導(dǎo)幾個(gè)蛋白質(zhì)的生物合成，mRNA代謝很快，代謝半衰期一般以秒計(jì)，很少達(dá)到10min以上。第26頁/共52頁第26頁/共53頁(二)核蛋白體RNA(rRNA)的結(jié)構(gòu)與功能：

rRNA是細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA，與核糖體蛋白共同構(gòu)成核糖體蛋白質(zhì)的合成部位，參與蛋白質(zhì)的合成。核蛋白體由大亞基和小亞基組成。

1.原核生物：小亞基由16SrRNA和20多種蛋白質(zhì)組成。大亞基由5S、23SrRNA與30余種蛋白質(zhì)組成。2.真核生物：小亞基由18SrRNA與30余種蛋白質(zhì)組成。大亞基由5S、5.8S、28SrRNA和近50種蛋白質(zhì)構(gòu)成。第27頁/共52頁第27頁/共53頁(三)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)的結(jié)構(gòu)與功能1.tRNA的一級結(jié)構(gòu)

tRNA是細(xì)胞內(nèi)分子量最小的一類核酸，含有大量稀有堿基：如甲基化的嘌呤、雙氫尿嘧啶、次黃嘌呤和假尿嘧啶核苷。假尿嘧啶核苷與一般的嘧啶核苷區(qū)別在于以雜環(huán)上C-5而非N-1與糖環(huán)C-1′連成糖苷鍵。tRNA的作用是攜帶相應(yīng)的氨基酸將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核蛋白體上以供蛋白質(zhì)合成。

第28頁/共52頁第28頁/共53頁2.tRNA的二級結(jié)構(gòu)呈三葉草樣二級結(jié)構(gòu)：一些能局部互補(bǔ)配對的區(qū)域形成局部對鏈，不能配對的部分膨出成環(huán)狀。此結(jié)構(gòu)從5′末端起第一個(gè)環(huán)為二氫尿嘧啶環(huán)（DHU），

第二個(gè)環(huán)為反密碼子環(huán)，因其環(huán)中部的三個(gè)堿基可與mRNA中三聯(lián)體密碼子形成堿基互補(bǔ)配對，在蛋白質(zhì)合成過程中解讀密碼子，把正確的氨基酸引入合成位點(diǎn)。第三個(gè)環(huán)為假尿嘧啶環(huán)（TψC環(huán)（胸苷T、假尿嘧啶核苷ψ、胞苷C）），所有tRNA3′末端為CCA-OH結(jié)構(gòu)，與氨基酸在此縮合成氨基酰-tRNA，起到轉(zhuǎn)運(yùn)氨基的作用。第29頁/共52頁第29頁/共53頁3.tRNA的三級結(jié)構(gòu)

tRNA的三級結(jié)構(gòu)呈倒L形，TψC環(huán)與DHU在二級結(jié)構(gòu)上各處一方，但在三級結(jié)構(gòu)上卻相距很近，維系tRNA三級結(jié)構(gòu)主要是依賴核苷酸之間形成的各種氫鍵。

第30頁/共52頁第30頁/共53頁(四)第31頁/共52頁第31頁/共53頁RNA組學(xué)（RNomics)研究細(xì)胞中snmRNAs的種類、結(jié)構(gòu)和功能。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同時(shí)間、不同狀態(tài)下SnmRNAs的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性。第32頁/共52頁第32頁/共53頁第33頁/共52頁第33頁/共53頁四、核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用

（一）核酸的一般理化性質(zhì)①核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性。②DNA是線性高分子，粘度極大，在機(jī)械力作用下斷裂，因此提取DNA過程中應(yīng)注意不能過度用力，比如劇烈震蕩吹打等。第34頁/共52頁第34頁/共53頁③由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長處有最大吸收峰，這個(gè)性質(zhì)可用于核酸的定量測定。這要與pr在280mm波長處有最大的吸收峰相區(qū)別，又因?yàn)榉肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)核酸提取過程中，蛋白質(zhì)是最常見的雜質(zhì)，故常用OD260/OD280

檢測提取的核酸純度如何。第35頁/共52頁第35頁/共53頁第36頁/共52頁第36頁/共53頁(二)DNA的變性、復(fù)性和雜交1.變性，這是DNA最重要的一個(gè)性質(zhì)。第37頁/共52頁第37頁/共53頁①DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為DNA變性。DNA變性只涉及二級結(jié)構(gòu)改變，不伴隨一級共價(jià)鍵的斷裂。第38頁/共52頁第38頁/共53頁②監(jiān)測DNA是否變性的一個(gè)最常用的指標(biāo)是DNA在紫外區(qū)260nm波長處的吸收光值變化。因?yàn)镈NA變性時(shí)，DNA雙鏈發(fā)生解離，共軛雙鍵更充分暴露，故DNA變性，DNA在260nm處的吸收光度值增加，并與解鏈程度有一定的比例關(guān)系，這種關(guān)系叫做DNA的增色效應(yīng)。第39頁/共52頁第39頁/共53頁③DNA的變性從開始到解鏈完全，是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值增加達(dá)到最大增加值的50％時(shí)的溫度叫做DNA的解鏈溫度（Tm）。一種DNA分子的Tm值的大小與其所含堿基中的G＋C的比例相關(guān)也與DNA分子大小及變性條件有關(guān)，G+C的比例越高，DNA分子越長，溶液離子強(qiáng)度越高，Tm值越大。第40頁/共52頁第40頁/共53頁④加熱、低鹽及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿均可使DNA變性。第41頁/共52頁第41頁/共53頁2.復(fù)性:

變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程也叫退火，一般認(rèn)為，比Tm值低25℃的溫度是DNA復(fù)性的最佳條件。復(fù)性時(shí)DNA在260nm處的吸收光度值減少,這叫減色效應(yīng).第42頁/共52頁第42頁/共53頁3.DNA變性復(fù)性的實(shí)際應(yīng)用

雜交：通過變性DNA的復(fù)性性質(zhì)，我們可知道，DNA單鏈之間、RNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間只要存在序列互補(bǔ)配對區(qū)域，不管是整條鏈互補(bǔ)，還是部分序列互補(bǔ)，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交，這在分子生物學(xué)研究中有極大的應(yīng)用.第43頁/共52頁第43頁/共53頁比如：雜交涉可用于在基因組中對特異基因的定位及檢測，PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因等，很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用的都是核酸分子雜交的原理，如SouthernBlot,NorthernBlot,包括PCR技術(shù)等。第44頁/共52頁第44頁/共53頁五、核酸酶指水解核酸的酶，根據(jù)底物不同分DNA酶、RNA酶，根據(jù)作用位點(diǎn)不同分核酶外切酶和核酸內(nèi)切酶，其中限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用尤為重要.第45頁/共52頁第45頁/共53頁第46頁/共52頁第46頁/共53頁六.核酸的序列測定DNA測序法Sanger測序法酶法Gilbert測序法化學(xué)法(Sanger雙脫氧法)第47頁/共52頁第47頁/共53頁酶法的技術(shù)基礎(chǔ):(1)凝膠電泳可分離大小僅差一個(gè)核苷酸的DNA片段;(2)用合適的聚合酶可以在試管中合成單鏈DNA模板的互補(bǔ)鏈.(一)酶法測序第48頁/共52頁第48頁/共53頁Sanger雙脫氧法測序原理

DNA的復(fù)制需要：DNA