生物化學(xué)實驗第1頁/共144頁實驗基本知識

第2頁/共144頁第3頁/共144頁第4頁/共144頁第5頁/共144頁第6頁/共144頁第7頁/共144頁容量瓶第8頁/共144頁液體的量取第9頁/共144頁第10頁/共144頁液體的傾倒第11頁/共144頁滴管的使用第12頁/共144頁試紙的使用第13頁/共144頁第14頁/共144頁第15頁/共144頁第16頁/共144頁一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液的配制第17頁/共144頁濾紙的折疊第18頁/共144頁物質(zhì)分離與提純－－過濾第19頁/共144頁萃取與分液第20頁/共144頁實驗內(nèi)容安排共36學(xué)時1、緒論生物化學(xué)實驗規(guī)則及常用儀器使用入門（2學(xué)時）2、實驗一紙層析分離鑒定氨基酸

（6學(xué)時）3、實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

（4學(xué)時）4、實驗三蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

（2學(xué)時）5、實驗四蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng)

（3學(xué)時）6、實驗五凝膠過濾法除蛋白質(zhì)中的離子

（4學(xué)時）第21頁/共144頁7、實驗六酵母RNA的提取和鑒定

(4學(xué)時)8、實驗七血糖含量的測定

（4學(xué)時）9、實驗八脂肪酸的β-氧化

（5學(xué)時）10、實驗報告講解及考核（2學(xué)時）第22頁/共144頁1

實驗?zāi)康恼莆盏鞍踪|(zhì)、酶、核酸、糖等重要物質(zhì)的分離、純化和測定技術(shù)的原理及方法；掌握生物化學(xué)的基本知識、基本理論及基本實驗技能；培養(yǎng)分析和解決問題能力以及嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的科學(xué)作風(fēng)、創(chuàng)新能力等綜合素質(zhì)。

緒論第23頁/共144頁2通過生物化學(xué)實驗應(yīng)該做到學(xué)習(xí)設(shè)計一個實驗的基本思路，掌握各個實驗的基本原理，學(xué)會嚴(yán)密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間。訓(xùn)練實驗的動手能力，學(xué)會熟練地使用各種生物化學(xué)實驗儀器。學(xué)會準(zhǔn)確翔實地記錄實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實驗報告的寫作能力，能夠整齊清潔地進(jìn)行所有的實驗。掌握生物化學(xué)的各種基本實驗方法和實驗技術(shù)，尤其是各種電泳技術(shù)和層析枝術(shù)，為今后參加科研工作打下堅實的基礎(chǔ)。第24頁/共144頁3.1實驗記錄實驗前寫好實驗預(yù)習(xí)報告(鋼筆和園珠筆)。實驗中應(yīng)及時準(zhǔn)確地記錄(專用紙，事先在記錄紙上設(shè)計好各種記錄格式和表格）所觀察到的現(xiàn)象和測量的數(shù)據(jù)。實驗記錄要注意有效數(shù)字，如吸光度值應(yīng)為“0.050”，而不能記成“0.05”。每個結(jié)果都要盡可能重復(fù)觀測二次以上，即使觀測的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應(yīng)如實記錄，不得涂改。實驗中要詳細(xì)記錄實驗條件，如使用的儀器型號、編號、生產(chǎn)廠等；生物材料的來源、試劑的規(guī)格、試劑的濃度等。

3實驗記錄與實驗報告第25頁/共144頁3實驗記錄與實驗報告3.2實驗報告實驗報告的格式應(yīng)為：⑴實驗?zāi)康模虎茖嶒炘?；⑶儀器、材料和試劑；⑷實驗步驟；⑸結(jié)果討論（含數(shù)理據(jù)處）；⑹注意事項;(7)思考題注意：實驗結(jié)果的討論要充分，盡可能多查閱一些有關(guān)的文獻(xiàn)和教科書，充分運用己學(xué)過的知識和生物化學(xué)原理，進(jìn)行深入的探討，勇于提出自己獨到的分析和見解，并歡迎對實驗提出改進(jìn)意見。第26頁/共144頁4實驗成績評分方法實驗預(yù)習(xí)情況（10%）實驗操作情況（20%）實驗報告情況（70%）第27頁/共144頁生物化學(xué)實驗技術(shù)理論層析技術(shù)第28頁/共144頁1903年，俄國科學(xué)家M.C.Jber首創(chuàng)了一種從綠葉中分離多種不同顏色色素成分的方法，命名為色譜法(Chromatography)，由于翻譯和習(xí)慣的原因．又常稱為層析法。80多年來，層析法不斷發(fā)展，形式多種多樣。50年代開始，相繼出現(xiàn)了分配層析、離于交換層析、凝膠層析、親和層析、吸附層析等。幾乎每一種層析法都已發(fā)展成為一門獨立的生化高技術(shù)，在生化領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。一、層析技術(shù)第29頁/共144頁一、層析技術(shù)1、層析技術(shù)原理2、層析技術(shù)分類3、常用層析技術(shù)原理第30頁/共144頁1、層析技術(shù)原理層析原理：是一種物理的分離方法，利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過此相稱作流動相，并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離的目的。可分離物質(zhì)：糖類、有機酸、氨基酸、核苷酸。第31頁/共144頁2、層析技術(shù)分類名稱操作方式固定相流動相分離依據(jù)分配層析紙層析薄層層析液體液體溶解度離子交換層析離子交換柱層析固體液體帶電性靜電引力吸附層析吸附薄層層析氣體吸附層析固體固體液體氣體吸附力親合層析酶與底物抗原與抗體固體液體配體專一性凝膠層析凝膠過濾固體液體分子大小第32頁/共144頁3、常用的層析原理（1）分配層析——紙層析原理：溶質(zhì)在互不相溶的兩相中溶解度不同，在終點時達(dá)到一種平衡，其比值為一個常數(shù)，即分配系數(shù)（α）。固定相內(nèi)溶質(zhì)的濃度流動相內(nèi)溶質(zhì)的濃度固定相：濾紙上吸附的水流動相：有機溶劑（正丁醇）α=第33頁/共144頁128646432643216484816832483284204040204212304030122第34頁/共144頁紙層析紙層析是最簡單的液一液相分配層析。濾紙是紙層析的支持物。當(dāng)支持物被水飽和時，大部分水分子被濾紙的纖維素牢牢吸附，因此，紙及其飽和水為層析的固定相，與固定相不相混溶的有機溶劑為層析的流動相。對某些特定化合物，在特定的展層系統(tǒng)，一定的溫度條件下，Rf是個常數(shù)。第35頁/共144頁（2）離子交換層析原理：將能與周圍介質(zhì)進(jìn)行離子交換的不穩(wěn)定離子固定于惰性基質(zhì)上，從而分離介質(zhì)中的組分。常用的惰性基質(zhì)：人工合成樹脂（單體：苯乙烯、交聯(lián)劑：二乙烯苯）陽離子交換劑：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基陰離子交換劑：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基可交換離子：陽離子：Na+、H+

陰離子：Cl-、OH-第36頁/共144頁示意圖（交換樹脂表面）第37頁/共144頁示意圖（離子交換過程）電離基團(tuán)（磺酸根）可交換離子（鈉離子）交換離子不交換離子第38頁/共144頁示意圖水分子B物質(zhì)A物質(zhì)第39頁/共144頁（3）吸附層析原理：當(dāng)氣體或液體中某組分的分子在運動中碰到一個固體表面時，分子會貼在固體表面上并停留一定時間然后才離開，此為吸附現(xiàn)象。吸附現(xiàn)象形成的原因：吸附作用可能由幾種作用力形成，包括被吸附物與吸附劑之間相反電荷基團(tuán)與基團(tuán)之間的靜電引力(形成離子鍵)、氫鍵及范德華引力等。在不同條件下，占主要地位的作用力可能不同，也可能幾種力同時起作用吸附劑：氧化鋁、活性炭、硅膠；纖維素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。第40頁/共144頁吸附層析示意圖

吸附劑易吸附分子不易吸附分子第41頁/共144頁（4）親和層析原理：利用分子間具有專一親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。專一親和力分子對：酶與底物、特異性抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體載體：使親和物固相化的水不溶性化合物。如：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。第42頁/共144頁第43頁/共144頁（5）凝膠過濾原理：被分離物質(zhì)因分子大小不同，在凝膠中向下移動的速度不同。物質(zhì)進(jìn)入凝膠柱之后有兩種運動方式：垂直向下移動和無定向的擴(kuò)散運動。大分子物質(zhì)直徑大無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，只能分布于顆粒間隙中向下移動快，而小分子物質(zhì)可擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)，因此向下移動慢。凝膠物質(zhì)：馬鈴薯淀粉凝膠、瓊脂、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠。第44頁/共144頁第45頁/共144頁電泳技術(shù)一.電泳的概念二.電泳技術(shù)分類三.電泳技術(shù)基本原理四.幾種常見電泳方法的比較五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理第46頁/共144頁一.電泳的概念帶電質(zhì)點在電場中移動的現(xiàn)象。第47頁/共144頁二.電泳技術(shù)分類第48頁/共144頁三.電泳技術(shù)基本原理1.基本原理

不同的帶電顆粒在同一電場中泳動速度，主要與其所帶凈電荷量，分子量及分子形狀有關(guān)。

pH>pI分子帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動;

pH<pI分子帶正電荷,在電場中向負(fù)極移動;

泳動度u=v=d/t=dleV/lVt第49頁/共144頁2.影響電泳速度的因素(1)電場強度泳動速度與電場強度成正比常壓電泳(100—500V).2—10V/cm，幾小時或幾天；蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì);高壓電泳(500—1000V).20—200V/cm，幾分鐘；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物質(zhì);（2）溶液的pH值pH距待分離物質(zhì)的pI越遠(yuǎn)，泳動速度越大；（3）溶液離子強度離子強度越小,電動勢越大,泳動速度越快。（4）電滲現(xiàn)象：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。第50頁/共144頁四.幾種常見電泳的比較類型優(yōu)點缺點紙電泳設(shè)備操作簡單分辨率差，電滲現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電泳設(shè)備操作簡單，樣品用量少分辨率差瓊脂糖凝膠電泳快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴(yán)重聚丙烯酰胺凝膠電泳可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝離第51頁/共144頁五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理1.原理

具有電泳和分子篩的雙重作用2.聚丙烯酰胺凝膠的聚合單體：丙稀酰胺（Acr）交聯(lián)劑：甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)劑(Bis)

催化劑聚合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OCH2=CH-C-NH2OOCH2=CH-C-NH

-CH2-NH-C-CH=CH2第52頁/共144頁五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理2.聚丙烯酰胺凝膠的聚合催化劑（1）過硫酸銨-TEMED系統(tǒng)堿性條件下催化作用溫度與聚合快慢成正比（2）核黃素-TEMED系統(tǒng)光激發(fā)的催化反應(yīng)用量少，對分析樣品無影響聚合時間可自由控制第53頁/共144頁五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理3.聚丙烯酰胺凝膠的孔徑凝膠越濃T，凝膠孔徑↓，所受阻力，機械強度丙稀酰胺濃度分離物質(zhì)分子量

4％大于100萬

7－7.5％1－100萬

15－30％小于1萬膠的孔徑為蛋白質(zhì)分子平均大小一半時效果好凝膠強度的選擇先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或4%--10%的凝膠梯度測試第54頁/共144頁五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理4.緩沖系統(tǒng)的選擇pH、離子種類和離子強度

酸性蛋白質(zhì)高pH

堿性蛋白質(zhì)低pH連續(xù)和不連續(xù)系統(tǒng)

電泳槽中的緩沖系統(tǒng)和pH與凝膠相同電泳槽中的緩沖系統(tǒng)和pH與凝膠相同，分辨率高第55頁/共144頁5.盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（1）盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的四個不連續(xù)性A.凝膠層的不連續(xù)性

濃縮膠T=2.8％C=20%；分離膠T=7％C=2.5%B.緩沖液成分的不連續(xù)性：凝膠緩沖液Tris-HCl,含Cl－，電極緩沖液Tris-Gly,Gly－C.pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH6.7,分離膠pH8.9，電極緩沖液pH8.3D.電位梯度的不連續(xù)性第56頁/共144頁5.盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（2）盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)第57頁/共144頁A.樣品的濃縮效應(yīng)緩沖液成分及pH的不連續(xù)性濃縮膠pH6.7緩沖液濃縮膠Tris-HCl,電極緩沖液Tris-Gly解離度：Cl>蛋>

Glymclcl>m蛋蛋>mGlyGly凝膠中Cl－為快離子，Gly－為慢離子，蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。

緩沖液樣品濃縮膠分離膠第58頁/共144頁緩沖液成分及pH的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品濃縮效應(yīng)示意圖快離子慢離子蛋白質(zhì)樣品

第59頁/共144頁E：每厘米的電壓降

E＝I(電流強度)/(電導(dǎo)率)E與電泳速度成正比電泳開始后，由于快離子泳動率最大，在快離子后面形成一個離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。電位梯度的不連續(xù)性第60頁/共144頁E：每厘米的電壓降

E＝I(電流強度)/(電導(dǎo)率)E與電泳速度成正比電泳開始后，由于快離子泳動率最大，在快離子后面形成一個離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。電位梯度的不連續(xù)性第61頁/共144頁A.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：緩沖液成分及pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性

緩沖液濃縮膠樣品分離膠第62頁/共144頁A.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)

蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。

緩沖液樣品濃縮膠分離膠第63頁/共144頁A.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)

蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。

緩沖液樣品濃縮膠分離膠第64頁/共144頁A.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)

蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。

緩沖液濃縮膠分離膠第65頁/共144頁A.樣品的濃縮效應(yīng)四個不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠層的不連續(xù)性：樣品進(jìn)入濃縮膠有一個堆積濃縮效應(yīng)(緩沖液pH8.3)

蛋白質(zhì)從“－”極向“＋”極移動，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。

緩沖液濃縮膠分離膠第66頁/共144頁B.電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后

pH增大(pH8.9)，Gly－解離度增大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場強度和pH條件下泳動。由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點的有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。

緩沖液濃縮膠分離膠第67頁/共144頁C.分子篩效應(yīng)分離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出不同的泳動速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球形的泳動速度最快。

緩沖液濃縮膠分離膠第68頁/共144頁實驗一氨基酸的分離與鑒定

——濾紙層析法第69頁/共144頁一、實驗?zāi)康?.通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法2.掌握氨基酸紙上層層析法的操作技術(shù)（點樣、平衡、展層、顯色、鑒定）

.第70頁/共144頁二、實驗原理1.是分配層析的一種。在紙上水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。當(dāng)有機相沿紙流動經(jīng)過層析點時，層析點上溶質(zhì)就在水相和有機相之間進(jìn)行分配，溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率也不同，因而可以彼此分開。2.氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)。3.物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值來表示的。在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。

Rf＝

原點到溶劑前沿的距離原點到層析點中心的距離第71頁/共144頁4.Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、PH層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。5.上層層析、下層層析、單向?qū)游?、雙向?qū)游?。?2頁/共144頁三、儀器、材料和試劑實驗儀器1．層析缸、培養(yǎng)皿、小燒杯、長頸漏斗2．毛細(xì)管、吹風(fēng)機、電熱鼓風(fēng)干燥箱3．層析濾紙、手套

、透明膠帶或針線實驗材料和試劑1．氨基酸溶液分別配制0.5%的Lys、Alu、Ile、Met溶液及它們的混合液（各組份濃度均為0.5%）。2．顯色劑0.1%水合茚三酮丙酮溶液。3．?dāng)U展劑（展層劑）酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（體積比），平衡溶劑與擴(kuò)展劑相同。每組配制30ml堿溶劑系統(tǒng)：正丁醇:12%氨水:95%乙醇＝13:3:3（體積比），平衡溶劑為12%氨水。第73頁/共144頁四、操作步驟與方法

溶劑前沿層析點原點溶劑前沿亮苯丙纈脯賴第74頁/共144頁1．將盛有擴(kuò)展劑10ml的小燒杯和培養(yǎng)皿置于密閉的層析缸中。2．戴手套取層析濾紙一張作標(biāo)記。3。點樣：干后重復(fù)點一次，直徑最大不超過3mm。縫成筒狀，兩邊不能接觸。點樣面朝外，點樣端朝下，蓋上層析缸蓋，平衡約20~30分鐘。4.展層用長頸漏斗，擴(kuò)展劑的液面需低于點樣線1cm。上沿約1厘米時，取出濾紙，用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿界線，干燥。5．顯色用0.1%茚三酮丙酮溶液均勻浸透，烘箱（65℃）5分鐘或用熱風(fēng)吹干。脯氨酸、羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α－氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮產(chǎn)生蘭紫色物質(zhì)。第75頁/共144頁五、實驗結(jié)果與討論

第76頁/共144頁六、注意事項1．切勿用手直接接觸濾紙和顯色劑。2.點樣過程中必須在第一滴樣品干后再點第二滴。3．使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。第77頁/共144頁七、思考題：1．做好本實驗的關(guān)鍵是什么？2．實驗操作過程，為何不能用手接觸濾紙？3．影響Rf值的因素有哪些？第78頁/共144頁實驗二血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳

第79頁/共144頁實驗原理實驗材料與儀器實驗試劑實驗步驟第80頁/共144頁實驗原理

醋酸纖維薄膜電泳(CAME)是以醋酸纖維薄膜(CAM)作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。將它溶于有機溶劑（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，滲透性強，對分子移動阻力小，厚度為120μm。本實驗以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點及形狀不同，在電場中的遷移速度不同。分子量小、等電點低的，在相同堿性PH緩沖體系中，帶負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場中遷移速度快。例如人血清蛋白在

PH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動最快，其余依次是球蛋白。第81頁/共144頁實驗材料與儀器

（一）、材料：人血清（二）、儀器醋酸纖維薄膜(8X2mm)；點樣器；染色皿，漂洗器，鑷子；玻璃板；常壓電泳儀；直流電源整流器；水平電泳槽；粗濾紙；直尺和鉛筆第82頁/共144頁實驗試劑

巴比妥緩沖液(pH8.6I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95％乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸餾水50ml；洗脫液0.4mol／LNaOH；透明液；無水乙醇；冰醋酸＝7：3第83頁/共144頁實驗步驟

1．浸泡：用鑷子取醋酸纖維薄膜放在緩沖液中浸泡20分鐘。2．點樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后鋪在玻璃板上(無光澤面朝上)，將點樣器在血清中沾一下（量薄薄一層為好），再在膜條一端2-3厘米處輕輕水平地落下并隨時提起，這樣即在膜條上點上了細(xì)條狀的血清樣品。第84頁/共144頁3．電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個電極槽內(nèi)的液面等高，將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。膜條點樣的一端放在負(fù)極上。通電，電流強度每條膜1mA(注意強度),電泳時間約為50分鐘。4．染色：電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡5分鐘。5．漂洗：將膜條從染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗數(shù)次至無蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。6．透明：將脫色后干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡

2～3分鐘后取出平鋪在玻璃板上,用一直徑0.5cm

的玻璃棒將其間的氣泡趕出,兩者之間不能有泡。干燥后此透明薄膜,區(qū)帶著色清晰,可用于光吸收掃描,長期保存不褪色。第85頁/共144頁思考題：１.為什么將薄膜的點樣端放在濾紙橋的負(fù)極端？２.用乙酸纖維素薄膜作為電泳支持物有何優(yōu)點？第86頁/共144頁實驗三蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗

——蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)第87頁/共144頁一、實驗?zāi)康模?）了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。（2）學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。

第88頁/共144頁二、實驗原理雙縮脲反應(yīng)尿素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一個肽鍵和一個—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)也有此反應(yīng)。NH3干擾此反應(yīng)，因為NH-3與Cu-2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。第89頁/共144頁茚三酮反應(yīng)除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，1∶1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜pH為5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。第90頁/共144頁黃色反應(yīng)含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。第91頁/共144頁乙醛酸反應(yīng)在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，反應(yīng)機理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。第92頁/共144頁三、儀器、材料和試劑實驗儀器試管；試管架；漏斗；鐵架臺；滴管；試劑瓶；水浴鍋。實驗材料和試劑尿素；10%氫氧化鈉溶液；1%硫酸銅溶液；2%卵清蛋白溶液；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；大豆提取液；頭發(fā)；指甲；0.5%苯酚溶液；濃硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；冰醋酸、濃硫酸。第93頁/共144頁四、操作步驟與方法

取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液2ml，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。雙縮脲反應(yīng)實驗操作第94頁/共144頁茚三酮反應(yīng)實驗操作①取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1~2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。②在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現(xiàn)。第95頁/共144頁黃色反應(yīng)實驗操作向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。管號1234567材料（滴）雞蛋清溶液4大豆提取液4指甲少許頭發(fā)少許0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4濃硝酸/（滴）244040444現(xiàn)象第96頁/共144頁乙醛酸反應(yīng)實驗操作

取3支試管。編號。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升，混勻后傾斜試管，沿管壁分別緩緩加入濃硫酸約1毫升，靜置。觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不明顯，可于水浴中微熱。試劑管號水滴0.03%色氨酸溶液（滴）蛋白質(zhì)溶液（滴）冰醋酸（ml）濃硫酸（ml）現(xiàn)象1--521241-2135--21第97頁/共144頁五、思考題：1.茚三酮反應(yīng)的陽性結(jié)果是否經(jīng)常是同一色調(diào)？并說明原因。2.你能區(qū)分蛋白質(zhì)茚三酮反應(yīng)及其他氨基化合物茚三酮反應(yīng)的結(jié)果嗎？試解釋之。3.能否利用茚三酮反應(yīng)可靠地鑒定蛋白質(zhì)的存在？4.哪些芳香基因（蛋白質(zhì)中的、非蛋白質(zhì)中的）可以與濃硝酸作用呈現(xiàn)黃色反應(yīng)的陽性結(jié)果？第98頁/共144頁實驗四蛋白質(zhì)的變性、沉淀反應(yīng)第99頁/共144頁一、實驗?zāi)康模?）加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識。（2）了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義。（3）了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。

第100頁/共144頁二、實驗原理

在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋怼５鞍踪|(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。（1）可逆的沉淀的反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應(yīng)。

第101頁/共144頁（2）不可逆沉淀反應(yīng)此時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機酸的反應(yīng)都屬于此類。蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。第102頁/共144頁三、儀器、材料和試劑

實驗材料和試劑

0.2%雞蛋清溶液；pH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液；3%硝酸銀溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結(jié)晶粉末；0.1mol·L-1鹽酸溶液；0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液；0.05mol·L-1碳酸鈉溶液；0.1mol·L-1醋酸溶液；甲基紅溶液；2%氯化鋇溶液；10%NaOH；飽和的NaCl；10%醋酸。

第103頁/共144頁四、操作步驟與方法

1．鹽析：加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。2．重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1~2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？3．某些有機酸沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。第104頁/共144頁4．加熱沉淀蛋白質(zhì)：取5支試管，編號。依下表順序加入試劑：

將各管混勻，觀察記錄各管情況，然后，放沸水浴中加熱10min，注意觀察各管的沉淀情況，最后將第3、4、5號管分別用10%NaOH或10%醋酸中和，觀察并解釋實驗結(jié)果。試劑管號蛋清蛋白質(zhì)（滴）0.1mol/L醋酸（滴）10%醋酸（滴）

飽和的NaCl（滴）10%NaOH(滴）蒸餾水（滴）110----72105---5310-5--5410-52--510---25第105頁/共144頁5．乙醇引起的變性與沉淀：取3支試管，編號。依下表順序加入試劑：

振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8ml，然后在第2、3號管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1mol·L-1醋酸溶液及0.05mol·L-1碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1mol·L-1鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。

試劑（ml）管號5%卵清蛋白溶液0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液0.1mol·L-1鹽酸溶液95%乙醇pH4.7緩沖溶液123111—1———11111——第106頁/共144頁五、思考題：1.雞蛋清為何可做鉛、汞中毒的解素劑？2．氯化汞為何能做為殺菌劑？

第107頁/共144頁實驗五凝膠過濾法使蛋白質(zhì)脫鹽

第108頁/共144頁一、實驗?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)凝膠過濾法分離純化物質(zhì)的原理與操作技術(shù)。第109頁/共144頁二、實驗原理

凝膠過濾也稱凝膠層析，其分離純化物質(zhì)的原理是，凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻在外部，當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子質(zhì)量被分開了。此法可用于測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、樣品的濃縮和脫鹽等方面。第110頁/共144頁

目前常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠，其中最常用的是葡聚糖凝膠。葡聚糖凝膠的商品名稱為Sephadex，它是葡萄糖通過α-1，6-糖苷鍵形成的葡聚糖長鏈，與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷以醚鍵相互交連而成的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，呈珠狀顆粒。第111頁/共144頁三、儀器、材料和試劑

實驗儀器鐵架臺；層析柱；滴定管夾；刻度離心管；白瓷板；SephadexG-25（粒度粗，50～100目）；細(xì)乳膠管；螺旋夾；燒杯。

實驗試劑

10%磺柳酸；納氏試劑（萘斯特試劑）；蛋白質(zhì)－(NH4)2SO4溶液；無離子水（洗脫液）

第112頁/共144頁四、操作步驟與方法

1.溶脹凝膠：用去離子水浸泡SephadexG-25凝膠24h以上（中間換一次水）或用去離子水沸水浴溶脹2h左右。2.凝膠裝柱：按實驗教程要求安裝層析裝置，將溶脹好的SephadexG-25裝入層析柱中。3.洗柱：接通洗脫液，按要求洗柱并調(diào)整好流速。4.加樣洗脫：吸取1ml樣品（蛋白質(zhì)－硫酸銨溶液），小心地加到床面上，擰松螺旋夾，待樣品全部進(jìn)入凝膠柱中，接通洗脫液，開始洗脫并收集洗脫液。5.收集檢查：每管收集1ml洗脫液。取洗脫液2滴加入白瓷板穴中，加入納氏試劑1滴，如有銨鹽洗脫下來，則有黃紅色沉淀。取洗脫液2滴置小試管中，加入磺柳酸1滴，如有蛋白質(zhì)洗脫下來，則有白色混濁或沉淀出現(xiàn)。第113頁/共144頁五、思考題：1.利用凝膠層析分離混合物時，怎樣才能得到較好的分離效果？2.還有哪些方法可進(jìn)行蛋白質(zhì)脫鹽？3.蛋白質(zhì)溶液中的鹽分為何能通過凝膠過濾方法被脫除？4.凝膠過濾法在蛋白質(zhì)分析中還有何應(yīng)用？第114頁/共144頁實驗六

酵母RNA的分離及組分鑒定

第115頁/共144頁一、實驗?zāi)康?1)學(xué)習(xí)稀堿法提取RNA的原理和操作方法。(2)了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸組分的方法。第116頁/共144頁二、實驗原理

酵母核酸中RNA含量較多。RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。

第117頁/共144頁三、儀器、材料和試劑實驗儀器

1．乳缽

2．150mL錐形瓶

3．水浴

4．量筒

5．布氏漏斗及抽濾瓶

6．吸管

7．滴管

8．試管及試管架

9．燒杯

10．離心機

11．漏斗。實驗試劑

1．氯化鐵濃鹽酸溶液

2．苔黑酚乙醇溶液

3．定磷試劑

（1）17％硫酸溶液

將17mL濃硫酸(比重1．84)緩緩加入到83mL水中。

（2）2．5％鉬酸銨溶液

將2．5g鉬酸銨溶于100mL水中。

（3）10％抗壞血酸溶液

10g抗壞血酸溶于100mL水中，貯棕色瓶保存。溶液呈淡黃色時可用，如呈深黃或棕色則失效，需純化抗壞血酸。

臨用時將上述3種溶液與水按如下比例混合。

17％硫酸溶液:2.5％鉬酸銨溶液:10％抗壞血酸溶液:水=1:1:1:2(V／V)。

4．酵母粉

第118頁/共144頁四、操作步驟與方法

1.提取將15g酵母懸浮于90mL0.04mol／L氫氧化鈉溶液中，并在乳缽中研磨均勻。將懸浮液轉(zhuǎn)移至150毫升錐形瓶中。在沸水浴上加熱30分鐘后，冷卻。離心(3000r／min)15分鐘，將上清液緩緩傾人30mL酸性乙醇溶液中。注意要一邊攪拌一邊緩緩傾人。待核糖核酸沉淀完全后，離心(3000r／min)3分鐘。棄去清液。用95％乙醇洗滌沉淀兩次，乙醚洗滌沉淀一次后，再用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。沉淀可在空氣中干燥。

取200mg提取的核酸，加入1.5mol／L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加熱10分鐘第119頁/共144頁2、制成水解液并進(jìn)行組分的鑒定（1）．嘌呤堿

取水解液1mL加入過量濃氨水，然后加入約1mL0．1mol／L硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物沉淀。

（2）．核糖

取1支試管加人水解液1mL、三氯化鐵濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0．2mL。放沸水浴中10分鐘。注意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。

（3）．磷酸

取1支試管，加入水解液1mL和定磷試劑ImL。在水浴中加熱，觀察溶液是否變成藍(lán)色，說明磷酸是否存在。第120頁/共144頁五、思考題：1．如何得到高產(chǎn)量RNA的粗制品?

2．本實驗RNA組分是什么?怎樣驗證的?

第121頁/共144頁實驗七血糖含量的測定（Folin-Wu法）

第122頁/共144頁一、實驗?zāi)康模?）理解血糖在生物體內(nèi)的重要意義。（2）掌握Folin-Wu法測定血糖含量的原理和方法。第123頁/共144頁二、實驗原理1.血糖指的是血液中哪一種糖？葡萄糖是血液主要的糖類，因此測血糖含量就是測血液中葡萄糖的含量。2.用什么方法測定？測定血液中葡萄糖的含量，即測復(fù)雜組分中一種物質(zhì)的量，根據(jù)生化實驗基本技術(shù)的原理，可采用分光光度法（比色法）進(jìn)行測定。3.葡萄糖可以用比色法直接測定嗎？不行，可以用間接的方法。血液中的葡萄糖與堿性硫酸銅溶液共熱，銅離子即被血液中的葡萄糖還原成氧化亞銅，后者又可使鉬酸試劑還原成低價的鉬藍(lán)（藍(lán)色）。血糖的含量與產(chǎn)生的氧化亞銅成正比，氧化亞銅的量與形成的鉬化合物的量成正比，可以用比色的方法進(jìn)行測定。

第124頁/共144頁三、儀器、材料和試劑

實驗儀器

分光光度計、血糖管、奧氏吸管、水浴鍋、表面皿（儀器的選擇在實驗開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報告中提出方案后教師審定）。

實驗試劑

1、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1）1%（m/V）葡萄糖母液稱取葡萄糖1.0g，溶于蒸餾水中，然后用100ml容量瓶定容至刻度。（2）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液用移液管吸取1%葡萄糖母液1.0ml，放入100ml容量瓶內(nèi)，然后定容至刻度。第125頁/共144頁實驗試劑2、堿性硫酸銅溶液（A、B液）（1）A液：稱取無水碳酸鈉35.0g，酒石酸鈉13.0g及碳酸氫鈉11.0g，用蒸餾水溶解，然后用1000ml容量瓶定容至刻度。（2）B液：稱取硫酸銅5.0g，用蒸餾水溶解，然后用100ml容量瓶定容至刻度，加幾滴濃硫酸作為保存劑。堿性硫酸銅（現(xiàn)配現(xiàn)用）

取A液25ml,B液5ml，混合后，再用A液定容至50ml，搖勻。該混合液在4℃冰箱里可保存數(shù)日，如果暴露于陽光下，數(shù)小時即失效。第126頁/共144頁實驗試劑與材料3、酸性鉬酸鹽溶液稱取鉬酸鈉104.6g，置燒杯中用蒸餾水溶解，倒入500ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，然后移入另一較大的試劑瓶中，加溴水0.5ml，搖勻，靜置數(shù)小時。置于1000ml容量瓶中，緩慢加入85%（V/V）H3PO4225ml，邊加邊搖勻。再加入25%（V/V）硫酸150ml，置暗處至次日，用空氣將剩余的溴趕去，加入冰乙酸75ml，搖勻，加蒸餾水稀釋至1000ml，貯存于棕色瓶中。4、10％（m/V）鎢酸鈉溶液5、0.33mol/L硫酸溶液6、動物血（家兔心臟取血）第127頁/共144頁四、操作步驟與方法

1.無蛋白血濾液的制備先在燒杯中加0.8g左右的抗凝劑（草酸鉀或草酸鈉），從家兔心臟取血10ml放入燒杯，振蕩搖勻。用奧氏吸管吸取已加抗凝劑的全血1ml，緩緩放入20ml錐形瓶中，加水7ml，搖勻，血液變成紅色透明時加10％鎢酸鈉1ml，搖勻，再加0.33mol/L硫酸，隨加隨搖，加完放置5～15min，至沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣?，濾紙過濾。每毫升無蛋白血濾液相當(dāng)于0.1ml全血。第128頁/共144頁2.血糖的測定取具25ml刻度的血糖管3只，編號，用奧氏吸管吸取無蛋白血濾液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加2ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸餾水。然后各加2ml新配置的堿性硫酸銅溶液，同時置沸水浴內(nèi)煮6min，取出，在流水中迅速冷卻，各加入4ml酸性鉬酸鹽溶液，1min后以蒸餾水稀釋至25ml，混勻，倒入比色杯，用722型風(fēng)光光度計于420～440nm波長比色（先以空白管調(diào)節(jié)零點，然后測標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管）。第129頁/共144頁3.計算按下式計算100ml全血中所含的血糖質(zhì)量（mg）。m＝A1×C0÷A0÷0.1×100式中：m：100ml血中所含的糖質(zhì)量C0：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度A1：樣品溶液吸光度A0：標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度第130頁/共144頁五、注意事項1.欲得準(zhǔn)確結(jié)果，所取血液的量必須準(zhǔn)確。如果由吸管中放出血液的速度太快，會有大量血液粘在吸管內(nèi)壁，容量不準(zhǔn)，所以一般放出1ml血液所用的時間不應(yīng)少于1min。2.沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣且蜴u酸鈉與硫酸作用生成鎢酸，在適當(dāng)酸度時，使血紅蛋白變性、沉淀。如血沉淀放置后不變?yōu)樽丶t色或重濾后仍混濁，可在鎢酸與血混合液中加入10％硫酸1～2滴，待變?yōu)榘底厣笤贋V。3.血液中除葡萄糖外，尚有其他還原性物質(zhì)，所以實驗結(jié)果可能偏高20%～30%。第131頁/共144頁六、思考題：1．移液管使用時應(yīng)注意哪些問題?

2．全血中除了葡萄糖還有哪些還原性物質(zhì)?第132頁/共144頁實驗八脂肪酸的β-氧化第133頁/共144頁一、實驗?zāi)康?/p>