【案例】3患兒，半歲，女。以突然發(fā)病出現(xiàn)發(fā)熱、水樣腹瀉和嘔吐等癥狀于2012年11月5日【討論題】你作為檢驗(yàn)人員，如何進(jìn)行采樣并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)確診？答：根據(jù)患兒表現(xiàn)出的癥狀（發(fā)熱、水樣腹瀉、嘔吐、蛋花樣糞便）以及患病時(shí)間（深秋季節(jié)），高度懷疑為患兒感染了輪狀病毒（rotavirus）；但是從患兒輕微脫水癥來看，患兒可能同時(shí)感染了腸道腺病毒（entericadenovirus）；雖然根據(jù)癥狀細(xì)菌感染的概率較小，但同時(shí)還應(yīng)該考慮到一些常見細(xì)菌的感染，例如：致病性大腸桿菌、沙門菌、志賀痢疾桿菌、空腸彎曲菌等1、采樣：對(duì)患兒近期所食奶粉、奶瓶、患兒糞便、患兒血液、患兒近期接觸物品、與患兒接觸人群的手進(jìn)行采樣（對(duì)近期所食奶粉、奶瓶、患兒近期接觸物品、與患兒接觸人群的手進(jìn)行采樣檢測可以確定患兒感染途徑，對(duì)患兒糞便和血液進(jìn)行檢測可以確診引起患兒癥狀的原因）1.1嬰兒奶粉采樣：利用無菌鑰匙取30g奶粉于無菌采樣袋中，密封；1.2奶瓶：潔凈棉拭子采樣法；1.3患兒糞便：用采樣杯采集嬰兒新鮮糞便，避免尿不濕吸附影響檢測結(jié)果。于0度冰箱凍存，及時(shí)檢測；1.4患兒血液：普通真空采集管采集患兒足跟血；1.5患兒近期接觸物品：潔凈棉拭子采樣；1.6與患兒接觸人群的手：潔凈棉拭子采樣。注：采集樣本時(shí)應(yīng)注意交叉污染，并做好唯一標(biāo)記，樣本采集完后立即消毒洗手2、樣品前處理：奶粉:xxg奶粉加xxml無菌溫水溶解均勻?qū)⒉杉瘶悠酚蒙睇}水溶解或稀釋，然后做致病性大腸桿菌、沙門菌、志賀痢疾桿菌、空腸彎曲菌的培養(yǎng)3.實(shí)驗(yàn)室檢測3.1致病性大腸埃希菌樣品前處理以無菌操作量取檢樣25mL,加入裝有225mL營養(yǎng)肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠),振蕩混勻。增菌將制備的樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)6h。取10μL,接種于30mL腸道菌增菌肉湯管內(nèi),于42℃±1℃培養(yǎng)18h。分離將增菌液劃線接種MAC和EMB瓊脂平板,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,觀察菌落特征。在MAC瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色,不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色;在EMB瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤,不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。同時(shí),另取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi),于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

5.3分離

分別用直徑3mm的接種環(huán)取增菌液1環(huán),劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板(或HE

瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板),于36℃±1℃分別培養(yǎng)40h~48h(BS瓊脂平板)或18h~24h

(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板),觀察各個(gè)平板上生長的菌落,各個(gè)平板

上的菌落特征見表1。

表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰綠

色的菌落,周圍培養(yǎng)基不變HE瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色,多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色;有些菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色XLD瓊脂菌落呈粉紅色,帶或不帶黑色中心,有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心,或呈現(xiàn)全部黑色

的菌落;有些菌株為黃色菌落,帶或不帶黑色中心沙門氏菌屬顯色培

養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進(jìn)行判定

5.4生化試驗(yàn)

5.4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落,接種三糖鐵瓊脂,先在斜面劃線,再于

底層穿刺;接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板,于36℃±1℃培養(yǎng)

18h~24h,必要時(shí)可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi),沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表2。GB4789.4—20164

表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果

5.4.2接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí),可直接接種蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、

尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基,也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接

種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,必要時(shí)可延長至48h,按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲(chǔ)存

于2℃~5℃或室溫至少保留24h,以備必要時(shí)復(fù)查。

表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào)硫化氫(H2S)靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀(KCN)賴氨酸脫羧酶A1+---+A2++--+A3----+/-注:+陽性;-陰性;+/-陽性或陰性。

5.4.2.1反應(yīng)序號(hào)A1:典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異

常,按表4可判定為沙門氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門氏菌。

表4沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

5.4.2.2反應(yīng)序號(hào)A2:補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn),沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽性,但

需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。

5.4.2.3反應(yīng)序號(hào)A3:補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌,同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙

門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。

5.4.2.4必要時(shí)按表5進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。

GB4789.4—2016

5

表5沙門氏菌屬各生化群的鑒別項(xiàng)目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇++——+—山梨醇+++++—水楊苷———+——ONPG——+—+—丙二酸鹽—++———KCN———++—注:+表示陽性;—表示陰性。

5.4.3如選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng),可根據(jù)5.4.1的初步判斷結(jié)果,從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落,用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?使用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。3.4空腸彎曲菌1.樣本處理

2.增菌

Bolton

肉湯預(yù)增菌，微需氧36

℃±1

℃培養(yǎng)4h

Bolton

肉湯增菌，微需氧42℃±1℃培養(yǎng)24h

~48h

3.平板接種取適量增菌液

接種在skirrow

與mccd

瓊脂平板，或顯色培養(yǎng)基

42℃±1℃培養(yǎng)24~48h

。挑取平板上可疑菌落，接種哥倫比亞血瓊脂平板

42℃±1℃

培養(yǎng)24~48h

4.形態(tài)觀察形態(tài)觀察挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢5.4.1.3動(dòng)力觀察挑取可疑挑取可疑菌落用1mLmLmL布氏肉湯懸浮，用相差顯微鏡觀察運(yùn)動(dòng)狀態(tài)布氏肉湯懸浮，5.氧化酶試驗(yàn)銥接種環(huán)或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上，如果在氧化酶試劑潤濕的濾紙上，如果在10s內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭或深藍(lán)色為陽性。6.微需氧條件下25℃±1℃生長試驗(yàn)挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下25℃±1℃培養(yǎng)44h±4h，觀察細(xì)菌生長情況。7.有氧條件下42℃±1℃生長試驗(yàn)挑取可疑菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，有氧條件下，42℃±1℃培養(yǎng)44h±4h，觀察細(xì)菌生長情況。3.5輪狀病毒和腸道腺病毒取糞便進(jìn)行輪狀病毒和腸道腺病毒的檢測（電鏡直接觀察檢測、抗原檢測、核酸檢測等），但是考慮到時(shí)效性、經(jīng)濟(jì)性和易行性選擇抗原檢測（ELISA法檢測輪狀病毒抗原、ELISA法檢測輪狀病毒抗體、免疫層析法等），采用德國R-Biopharm公司的輪狀病毒和腺病毒雙聯(lián)免疫層析快速檢測試劑條（該法靈敏度和特異性均高達(dá)99%）可以快速準(zhǔn)確的確診引起患兒癥狀的是否為輪狀病毒和腸道腺病毒。4、預(yù)期