實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌的革蘭氏染色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私飧锾m氏染色法的原理，學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色。利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是因?yàn)榧?xì)菌的等電點(diǎn)較低，約在pH2～5之間，故在中性、堿性或弱堿性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的堿性染料如結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、沙黃（番紅）等結(jié)合，使細(xì)菌被染成紫色或紅色。G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色紫色。三、實(shí)驗(yàn)儀器及材料1.儀器：顯微鏡、酒精燈等2.實(shí)驗(yàn)材料：菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌染色劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、番紅、95%乙醇

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟革蘭氏染色流程圖涂片干燥結(jié)晶紫染色碘液媒染水洗95%酒精脫色水洗番紅染色水洗晾干鏡檢固定水洗

1．涂片

取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥

涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。7．復(fù)染將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅染液復(fù)染1min，水洗，吸去殘水晾干。8、鏡檢

待標(biāo)本片置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。繪出細(xì)菌的形態(tài)圖并說明革蘭氏染色的結(jié)果。9.混合涂片染色注意事項(xiàng)：1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽性菌。2.菌齡也有影響。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。3.不要涂片太厚，會(huì)造成假陰性或假陽性。

六、思考題