第三章

核酸NucleicAcid

DNA堿基順序的測(cè)定

RNA堿基順序的測(cè)定第四節(jié)

核酸堿基序列順序分析

(Sequenceanalysisofnucleicacids)DNA堿基順序測(cè)定的基本步驟DNA片斷的制備DNA堿基順序測(cè)定

雜交測(cè)序法質(zhì)譜法單分子測(cè)序法原子探針顯微鏡測(cè)序法DNA芯片法

化學(xué)降解法

(Maxam-Gillbert法,1977)雙脫氧鏈終止法

(sanger法,1977)新技術(shù)方法核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis經(jīng)典方法一、以化學(xué)裂解反應(yīng)為基礎(chǔ)—化學(xué)降解法基本原理：基于有機(jī)化學(xué)方法，選擇性地切斷核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯鍵，得到不同鏈長(zhǎng)的DNA小片段；將這些片段經(jīng)電泳分離；分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。主要兩個(gè)步驟：堿基選擇性水解；對(duì)水解產(chǎn)物DNA小片段進(jìn)行電泳分析和堿基順序的推斷。硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中嘌呤堿基選擇性水解，分別得到兩種嘌呤堿基的甲基化產(chǎn)物：N3-甲基腺嘌呤核苷和N7-甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷；肼：使DNA分子中嘧啶堿選擇性水解，胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙3′-位的磷酸酯鍵則被水解斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應(yīng)。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學(xué)試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。特異性堿基化學(xué)切割反應(yīng)(1)化學(xué)裂解法測(cè)定DNA的核苷酸序列返回二、以使用DNA聚合酶為基礎(chǔ)--DNA鏈末端終止法

基本原理：以DNA的酶促合成為基礎(chǔ)，以被測(cè)DNA單鏈為模板，通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的“末端終止技術(shù)合成出一系列相差一個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的互補(bǔ)鏈，然后利用凝膠電泳分離這些不同長(zhǎng)度的DNA小片段，以此推測(cè)確定待測(cè)DNA鏈的堿基順序。主要步驟包括：末端終止法合成不同長(zhǎng)度DNA小片段；DNA小片段電泳圖譜解析。1977年sanger發(fā)明末端終止法“加減法”Sanger雙脫氧終止法DNA酶法測(cè)序DNA自動(dòng)測(cè)序儀Sanger法發(fā)展過(guò)程*少一個(gè)－OH脫氧核苷酸與雙脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)2、雙脫氧鏈終止法基本原理：?直接引入雙脫氧核苷三磷酸作為鏈終止劑；?將待定DNA片斷分為4組，在反應(yīng)體系中仍然以DNA單鏈為模板，需要引物、

DNA聚合酶和4種dNTP(其中一種用32P/35S標(biāo)記)、一定比例不同種類(lèi)的終止劑2，3-雙脫氧三磷酸(ddNTP，特異性末端終止劑)；?在DNA合成反應(yīng)混合物的4種dNTP加入少量的一種ddNTP后，鏈的延伸將與偶而發(fā)生但卻非常特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止的位置之間的距離。分別得到ddAddTddGddC結(jié)尾的片段。返回DNA酶法測(cè)序三、DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。ddNTPs參與下的DNA復(fù)制Sanger法測(cè)序產(chǎn)物的平均鏈長(zhǎng)取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時(shí)，得到較短的產(chǎn)物；“標(biāo)記／終止法”測(cè)序產(chǎn)物的平均長(zhǎng)度可通過(guò)標(biāo)記反應(yīng)中dNTP濃度(高濃度能得到長(zhǎng)的產(chǎn)物)或終止反應(yīng)的ddNTP:dNTP來(lái)調(diào)整。第二步熒光檢測(cè)DNA帶負(fù)電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關(guān)DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果RNA堿基順序測(cè)定方法RNA鏈堿基順序的測(cè)定比較復(fù)雜；逆轉(zhuǎn)錄法，以待測(cè)的RNA鏈為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶純化下，合成DNA(與RNA互補(bǔ)的DNA分子，常用cDNA表示)；用化學(xué)降解法

或雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA堿基順序，再得出RNA的堿基順序。應(yīng)用一套已知序列的寡核苷酸探針去尋找靶DNA鏈上的互補(bǔ)序列，靶DNA上的序列根據(jù)雜交情況來(lái)確定。雜交測(cè)序核酸分子的核苷酸序列分析是以純品核酸為材料，經(jīng)水解，測(cè)定核苷酸組成及比例；先以外切酶確定5′-或3′-末端核苷酸，再以內(nèi)切酶將核酸鏈分為若干寡核苷酸段，分段測(cè)定核苷酸組成、比例和序列；最后將核苷酸序列的各寡核苷酸重疊，確定整個(gè)核酸分子的核苷酸序列。核酸堿基順序測(cè)定酶底物作用部位作用產(chǎn)物外切酶磷酸二酯酶DNA，

RNA5′端，5′連接處3′核苷酸3′端，3′連接處5′核苷酸內(nèi)切酶脫氧核糖核酸酶IDNA3′連接處3′-羥核苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分脫氧核糖核酸酶II5′連接處3′-核苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸酶T1RNA5′連接處堿基是G3′-鳥(niǎo)苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸酶I5′連接處堿基是

Pyr3′-嘧啶類(lèi)核苷酸為3′末端寡核苷酸及剩余部分核苷酸序列分析中斷裂磷酸二酯鍵用酶返回第五節(jié)

核酸的催化性質(zhì)

Thecatalyticpropertiesofnucleicacids核酶（Ribozyme）核酶的發(fā)現(xiàn)核酶的催化性質(zhì)核酶的研究中的兩個(gè)問(wèn)題核酶的發(fā)現(xiàn)Altman發(fā)現(xiàn)RNase-P的蛋白部分不具催化功能，而RNA部分在有足夠濃度Mg2+離子存在下，能起核酸水解酶的作用。Cech發(fā)現(xiàn)RNA原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)的Pre-rRNA是一種具有自催化性能的核酶。證明了核酸既是信息分子，又是功能分子

核酶催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脫氧核苷酸片段，也能序列特異性降解RNA。催化性RNA(ribozyme)

序列特異性的核酸內(nèi)切酶參與RNA轉(zhuǎn)錄后加工修飾作為針對(duì)病毒或腫瘤基因的藥物降解mRNA。

核酶的催化性質(zhì)RNA作用于RNA核酸酶催化的反應(yīng)主要包括:水解反應(yīng)(RNA限制性內(nèi)切酶活性)，連接反應(yīng)(聚合酶活性)和轉(zhuǎn)核苷酰反應(yīng)等。最近核酸酶的其他作用底物也已被發(fā)現(xiàn)，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。核酶的催化過(guò)程圖轉(zhuǎn)酯作用轉(zhuǎn)酯作用核酸酶是指所有可以水解核酸的酶依據(jù)底物不同分類(lèi)DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)RNA酶(ribonuclease,RNase)依據(jù)切割部位不同分類(lèi)核酸內(nèi)切酶：

限制性核酸內(nèi)切酶非特異性核酸內(nèi)切酶核酸外切酶：

5′→3′或3′→5′核酸外切酶。參與DNA的合成與修復(fù)及RNA合成后的剪接等重要基因復(fù)制和基因表達(dá)過(guò)程負(fù)責(zé)清除多余的、結(jié)構(gòu)和功能異常的核酸，同時(shí)也可以清除侵入細(xì)胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收體外重組DNA技術(shù)中的重要工具酶生物體內(nèi)的核酸酶負(fù)責(zé)催化細(xì)胞內(nèi)外核酸的降解

核酸酶的功能

ThecrystalstructureoftheL1ligaseribozyme.(Credit:M.RobertsonandW.Scott(Science,March16,2007)“誰(shuí)先出現(xiàn)的呢，核酸還是蛋白質(zhì)？”這個(gè)問(wèn)題先前被看作是一個(gè)極難處理的矛盾，但隨著核酶的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在可以想象一個(gè)生命起源以前的‘RNA世界’，那里自我復(fù)制的酶執(zhí)行兩種功能?！犊茖W(xué)》雜志期刊X射線衍射技術(shù)確定核酶晶體結(jié)構(gòu)

TheStructuralBasisofRibozyme-CatalyzedRNAAssemblyMichaelP.RobertsonandWilliamG.Scott

Science16March2007:1549-1553.

ASYNTHETICRIBOZYMECATALYZESTHEBONDFORMATIONNECESSARYFORRNASYNTHESISBYTRANSITION-STATESTABILIZATIONANDACID-BASECATALYSIS,PERHAPS