酶工程第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

提取分離法微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶酶的生產(chǎn)方法生物合成法植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶化學(xué)合成法動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶

細(xì)胞培養(yǎng)方式固體培養(yǎng)發(fā)酵液體深層發(fā)酵固定化細(xì)胞發(fā)酵固體培養(yǎng)發(fā)酵以麩皮、米糠等為主要原料，加入其它必要的營養(yǎng)成分，制成固體或半固體的麩曲，經(jīng)過滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶微生物菌株，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，以獲得所需的酶。適合霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶，(原料便宜,操作簡單,但傳遞營養(yǎng)物質(zhì)困難,產(chǎn)量相對(duì)少)。液體深層發(fā)酵采用液體培養(yǎng)基，在生物反應(yīng)器中，經(jīng)滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶細(xì)胞，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)得到所需酶。

(酶的產(chǎn)率高，質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率高，是目前酶發(fā)酵的生產(chǎn)的主要方式。)第一節(jié)產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)第二節(jié)酶發(fā)酵工藝條件及控制第三節(jié)固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶第一節(jié)產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)一、產(chǎn)酶細(xì)胞的基本條件一般來說，能用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞必需具備的條件：1、酶的產(chǎn)量高2、容易培養(yǎng)和管理（生長速率高、營養(yǎng)要求低）3、產(chǎn)酶穩(wěn)定性好（不易退化）4、利于酶的分離純化5、安全可靠（不是致病菌）1)凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶,安全!2)由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實(shí)驗(yàn)。3)非常見微生物制取的酶,需做廣泛的毒性實(shí)驗(yàn),包括慢性中毒實(shí)驗(yàn)。二、酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物1、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）枯草芽孢桿菌是應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶微生物之一?？莶輻U菌是芽孢桿菌屬細(xì)菌。細(xì)胞成干狀，大小為（0.7—0.8）?*（2—3），?，單個(gè)，無莢膜，周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色陽性。菌落粗糙，不透明，污白色或微帶黃色。用于生產(chǎn)α—淀粉酶、蛋白酶、β—葡聚糖酶、堿性磷酸酶等。例如，枯草桿菌BF7658是國內(nèi)用于生產(chǎn)α—淀粉酶的主要菌株；枯草桿菌AS1.398可用于生產(chǎn)中性蛋白酶和堿性磷酸酶。枯草桿菌生產(chǎn)的α—淀粉酶和蛋白酶都是胞外酶。而堿性磷酸酶存在于細(xì)胞間質(zhì)之中。3、黑曲霉（Aspergillusniger）黑曲霉可用于生產(chǎn)多種酶，有胞外酶也有胞內(nèi)酶。如糖化酶、α—淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纖維素酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。4、米曲霉（Aspergillusoryzae）米曲霉可用于生產(chǎn)糖化酶和蛋白酶，這在我國傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲中得到廣泛應(yīng)用。此外，米曲霉還用于生產(chǎn)氨基酰化酶、磷酸酯酶、核酸酶P1、果膠酶等。6、木霉（Trichoderma）木霉是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。木霉產(chǎn)生的纖維素酶中包含有C1酶、CX酶和纖維二糖酶等。此外，木霉中含有較強(qiáng)的17α羥化酶，常用于甾體轉(zhuǎn)化。7、根霉（Rhizopus）

根霉用于生產(chǎn)糖化酶、α—淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。根霉有強(qiáng)的11α羥化酶，是用于甾體轉(zhuǎn)化的重要菌株。8、毛霉（Mucor）

毛霉的菌絲體在基質(zhì)上或基質(zhì)內(nèi)廣泛蔓延，菌絲體上直接生出孢子囊梗，分枝較小或單生，孢子囊梗頂端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常帶有針狀的草酸鈣結(jié)晶。

毛霉用于生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。10、啤酒酵母（Sacharomycescerevisiae）啤酒酵母主要用于釀造啤酒、酒精、飲料酒和面包制造。在酶的生產(chǎn)方面，用于轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等的生產(chǎn)。

11、假絲酵母（Candida）

假絲酵母的細(xì)胞圓形、卵形或長形。無性繁殖為多邊芽殖，形成假菌絲，可生成厚垣孢子、無節(jié)孢子、子囊孢子。不產(chǎn)生色素。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈乳白色或奶油色。

假絲酵母是單細(xì)胞蛋白的主要生產(chǎn)菌。在酶工程方面可用于生產(chǎn)脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶。假絲酵母具有烷類代謝的酶系，可用于石油發(fā)酵；具有較強(qiáng)的17羥基化酶，可用于甾體轉(zhuǎn)化制造睪丸素等。返回本節(jié)第二節(jié)酶發(fā)酵工藝條件及控制一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞活化：保藏細(xì)胞在使用之前必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動(dòng)能力。擴(kuò)大培養(yǎng)：活化了的細(xì)胞一般要經(jīng)過一級(jí)至數(shù)級(jí)的擴(kuò)大培養(yǎng)，以保證有足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞用于發(fā)酵生產(chǎn)。擴(kuò)大培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)期，或孢子成熟期二、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基氮源碳氮比碳源生長因子產(chǎn)酶促進(jìn)劑無機(jī)鹽123456注意：有些細(xì)胞生長繁殖階段和發(fā)酵階段所需培養(yǎng)基不同，要根據(jù)需要配制不同的生長培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。2．氮源氮是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。不同的細(xì)胞對(duì)各種氮源的要求各不相同，一般說來，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無機(jī)氮，微生物細(xì)胞中，異養(yǎng)型微生物用有機(jī)氮，自養(yǎng)型微生物用無機(jī)氮。

有機(jī)氮源主要是各種蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物。如：酪蛋白、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。無機(jī)氮源是含氮的各種無機(jī)化合物，如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等各種銨鹽和硝酸鹽等。使用時(shí)要注意C/N比值的不同3．無機(jī)鹽無機(jī)鹽的主要作用是提供細(xì)胞生命活動(dòng)不可缺少的無機(jī)元素，并對(duì)培養(yǎng)基的pH值、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。主要元素有：磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣等。微量元素有：銅、錳、鋅、鉬、鈷、碘等。微量元素是細(xì)胞生命活動(dòng)不可缺少的，但需要量很少，過量反而會(huì)引起不良效果，必須嚴(yán)加控制控制pH的方法：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C/N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時(shí)用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時(shí)，通過氮調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基中的成分與pH變化密切相關(guān)糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、磷酸鹽2、溫度的調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與最適生長溫度有所不同，而且往往低于最適生長溫度，這是由于在較低的溫度條件下，可提高酶的穩(wěn)定性，延長細(xì)胞產(chǎn)酶時(shí)間。在細(xì)胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，不斷放出熱量，會(huì)使培養(yǎng)基的溫度升高，同時(shí)，熱量不斷擴(kuò)散和散失，又會(huì)使培養(yǎng)基溫度降低，兩者綜合，決定了培養(yǎng)基的溫度．

溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發(fā)酵罐中，均設(shè)計(jì)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。

3、溶解氧的調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的生長繁殖以及酶的生物合成過程需要大量的能量。為了滿足細(xì)胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的需要，培養(yǎng)基中的能源物質(zhì)(一般是碳源提供)必須經(jīng)有氧降解才能產(chǎn)生大量的ATP。為此，必須供給充足的氧氣。生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的細(xì)胞，一般只能利用溶解在培養(yǎng)基中的氧氣——溶解氧。呼吸強(qiáng)度大的兩個(gè)階段：細(xì)胞生長對(duì)數(shù)期產(chǎn)酶高峰期及時(shí)通入無菌空氣調(diào)節(jié)溶氧速率的方法，主要有下列幾種：(1)調(diào)節(jié)通氣量(2)調(diào)節(jié)氧的分壓(3)調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間(4)調(diào)節(jié)氣液接觸面積(5)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液粘度(1)調(diào)節(jié)通氣量(2)調(diào)節(jié)氧的分壓通過調(diào)節(jié)空氣壓力或空氣中氧氣含量(3)調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間增加液層高度、反應(yīng)器中增設(shè)擋板(4)調(diào)節(jié)氣液接觸面積(5)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液粘度使空氣盡量分散（空氣分配管、攪拌裝置、擋板）加入消泡劑根據(jù)實(shí)際情況選擇使用，根據(jù)耗氧速率的改變而有效快捷地調(diào)節(jié)溶氧速率。若溶氧速率低于耗氧速率，則細(xì)胞得不到所需的供氧量，必然影響其生長和產(chǎn)酶；然而溶氧速率過高，對(duì)發(fā)酵也是不利的，一則造成浪費(fèi)，二則在高溶氧速率下會(huì)抑制某些酶的生成，如青霉素酰化酶等；另外，為獲得高溶氧速率而采用的大量通氣或快速攪拌等措施會(huì)使某些細(xì)胞（如霉菌、放線菌、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞、固定化細(xì)胞等）受到損傷。所以溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可。4、提高酶產(chǎn)量的措施除了選育優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，保證發(fā)酵工藝條件并根據(jù)需要和變化情況及時(shí)加以調(diào)節(jié)控制以外，還可以來取某些行之有效的措施，諸如添加誘導(dǎo)物，控制阻遏物濃度，添加表面活性劑或其他產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。1）添加誘導(dǎo)物對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物，可使產(chǎn)酶量顯著提高。誘導(dǎo)物一般可分為3類：

(1)酶的作用底物

(2)酶的反應(yīng)產(chǎn)物

(3)酶的底物類似物(一般不隨著菌生長而產(chǎn)生濃度變化,因此效果好,但要注意其對(duì)菌的化學(xué)毒性)2）控制阻遏物濃度阻遏作用有產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。阻遏物可以是酶催化反應(yīng)產(chǎn)物，代謝途徑的末端產(chǎn)物以及分解代謝物(葡萄糖等容易利用的碳源)?？刂谱瓒粑餄舛仁墙獬瓒簟⑻岣呙府a(chǎn)量的有效措施。1).產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。對(duì)于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除（移去；少加）。在培養(yǎng)基中添加抑制劑抑制尾產(chǎn)物形成的其它相關(guān)酶類去阻止尾產(chǎn)物形成的采用營養(yǎng)缺陷型突變菌株（調(diào)控基因，操縱基因突變）,該菌種酶不再受該產(chǎn)物阻遏(通常用類似結(jié)構(gòu)底物培養(yǎng)法)。為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應(yīng)當(dāng)控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度，防止分解代謝物過多而積累。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補(bǔ)料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）(2)控制阻遏物的濃度2).分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用。3）添加表面活性劑

表面活性劑可分為離子型和非離子型兩大類。由于離子型表面活性劑有些對(duì)細(xì)胞有毒害作用，特別是季胺型離子表面活性劑(如“新潔而滅”等)是消毒劑，不能用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)。

非離子型表面活性劑，如tween-80，有利于酶的分泌。4）添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但作用機(jī)理并未闡明清楚的物質(zhì)。添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑往往對(duì)提高酶產(chǎn)量有顯著效果。聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。返回本節(jié)四、酶生物合成的模式1.遲緩期（1）主要特征：代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類、ATP等；體積增大；分裂遲緩。（2）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關(guān)底物的酶。（3）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。

2.對(duì)數(shù)期（1）特點(diǎn)：分裂速度最快、代時(shí)最短、代謝活動(dòng)旺盛、對(duì)環(huán)境變化敏感。（2）作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵生產(chǎn)中用作種子的最佳菌齡。

3.穩(wěn)定期（1）特點(diǎn)：新生的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞數(shù)目相等、總菌數(shù)達(dá)到最大值、代謝活力鈍化。（2）原因：營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及代謝廢物的積累抑制了生長。（3）功能：產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對(duì)穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。

4.死亡期特點(diǎn)：活的細(xì)胞數(shù)目以對(duì)數(shù)速率急劇下降、細(xì)胞裂解或自溶。酶生物合成的四種類型比較酶產(chǎn)生與細(xì)胞生長的關(guān)系,可把酶生物合成模式分成4種類型:

酶的生物合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型。1、同步合成型（大部分組成酶，部分誘導(dǎo)酶）酶的生物合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長期時(shí)，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨著停止。同步合成型酶的生物合成可以由其誘導(dǎo)物誘導(dǎo)生成，不受分解代謝物的阻遏作用，不受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔谩．?dāng)除去誘導(dǎo)物或細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，這表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA是很不穩(wěn)定的。2、延續(xù)合成型（組成酶或誘導(dǎo)酶）

酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時(shí)間。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物以含有葡萄糖的果膠為誘導(dǎo)物延續(xù)合成型的酶可受誘導(dǎo)不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏。在生長平衡期以后相當(dāng)長所一段時(shí)間內(nèi)繼續(xù)用于酶的合成。因此該酶所對(duì)應(yīng)的mRNA是相當(dāng)穩(wěn)定的，3、中期合成型：（1）酶的合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成也隨著停止。酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔没蚍纸獯x物阻遏作用，其所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml4、滯后合成型（水解酶）：

（1）在細(xì)胞生長一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。

能在細(xì)胞停止生長后，進(jìn)繼續(xù)利用積累的mRNA進(jìn)行翻譯而合成酶，因此酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。

產(chǎn)生原因：

由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后的相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。酶生物合成的四種類型（1）同步合成型：酶的合成與細(xì)胞的生長同步進(jìn)行。mRNA不穩(wěn)定。（2）延續(xù)合成型：酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始，生長進(jìn)入平衡期后，酶又延續(xù)合成一段時(shí)間。mRNA穩(wěn)定。（3）中期合成型酶的合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間后才開始，進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨之停止。mRNA不穩(wěn)定，受阻遏物影響。

(4)滯后合成型當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，才開始并大量積累酶。

mRNA穩(wěn)定，受阻遏物影響。mRNA不穩(wěn)定穩(wěn)定期不合成酶mRNA穩(wěn)定穩(wěn)定期合成酶受阻遏物影響酶的合成推遲不受阻遏物影響隨細(xì)胞生長開始酶的合成理想的酶合成模式酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式應(yīng)是延續(xù)合成型。對(duì)于其他合成模式的酶，可以通過基因工程\細(xì)胞工程等先進(jìn)技術(shù),選育得到優(yōu)良的菌株,并通過工藝條件的優(yōu)化控制,使他們的生物合成模式更加接近于延續(xù)合成型。mRNA不穩(wěn)定穩(wěn)定期不合成酶mRNA穩(wěn)定穩(wěn)定期合成酶受阻遏物影響酶的合成推遲不受阻遏物影響隨細(xì)胞生長開始酶的合成同步合成型酶提高mRNA穩(wěn)定性中期合成型酶提高mRNA穩(wěn)定性、解除阻遏滯后合成型酶解除阻遏改造非理想模式（1）選擇最理想的酶合成模式——延續(xù)合成型；（2）改造非理想模式

A、同步合成型：適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提高相應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性；

B、滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶合成提早開始；

C、中期合成型：努力提高mRNA穩(wěn)定性，解除代謝物阻遏物。選擇與改造第三節(jié)固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶固定化細(xì)胞又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞，是指用各種