培養(yǎng)用液教學目的:1、掌握細胞培養(yǎng)對水的要求。2、了解常用的平衡鹽溶液的配制及使用方法。3、了解細胞培養(yǎng)常用液有那些。4、了解常用的培養(yǎng)液的種類。Balancedsaltsolution,BSS組成：無機鹽、葡萄糖作用：1、維持滲透壓、保持pH值穩(wěn)定、提供簡單營養(yǎng)；2、濕潤組織，防止組織塊干涸，并能洗滌組織塊上的血污、雜質(zhì)；3、作為配制其它溶液的基礎(chǔ)溶液（消化液：分散細胞；抗生素溶液；基礎(chǔ)培養(yǎng)基等）一、平衡鹽溶液（BSS）用途：清洗材料、洗滌細胞、配制其他溶液。常用的幾種平衡鹽溶液分類：按來源分：天然培養(yǎng)基人工合成培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）按基質(zhì)狀態(tài)分：半固體:瓊脂，明膠，血漿液體二、組織培養(yǎng)基92℃以上溶解46℃以下凝固思考題：細胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與微生物培養(yǎng)基有什么區(qū)別？生長液：基本培養(yǎng)基加入8%-10%的血清；維持液：基本培養(yǎng)基加入3%-5%的血清；完全培養(yǎng)基：人工合成培養(yǎng)基加上血清；基礎(chǔ)培養(yǎng)基又叫做人工合成培養(yǎng)基。一、培養(yǎng)基的基本要求（一）營養(yǎng)成分（二）促生長因子及激素（三）滲透壓（四）pH（五）無毒無污染營養(yǎng)成分（1）氨基酸：細胞合成蛋白的原料包括：12種必需氨基酸和谷氨酰胺（2）單糖：六碳糖是最主要的能量來源（3）維生素：在細胞代謝過程中扮演輔酶、輔基的角色（4）無機離子及微量元素

當細胞內(nèi)、外環(huán)境的分子濃度不同時就會產(chǎn)生滲透壓。這種情況下，水分通過滲透流入或流出細胞，從而改變細胞的內(nèi)環(huán)境。高滲透壓迫使水分從細胞中擴散出來導(dǎo)致細胞收縮，這種情況會使DNA和蛋白遭到破壞、細胞周期停滯以及最終使細胞死亡。

人血漿滲透壓為290mOsm/Kg，可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓，相當于7倍的大氣壓。滲透壓

PH值細胞生長的最適PH為7.2-7.4密閉培養(yǎng)時長生的CO2與水結(jié)合能產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基的PH值會很快下降，對細胞產(chǎn)生有害影響。NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)NaHCO3+H2ONa++H2O+OH-+CO2CO2穩(wěn)定則上述反應(yīng)平衡，PH值也相對恒定（二）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基,常用的有血清、淋巴液、雞胚浸出液及一些促貼壁的膠原成分等。優(yōu)點：營養(yǎng)豐富，培養(yǎng)效果好。缺點：成分復(fù)雜；來源受限；批間有差異;易污染。血清最常用，重要！2.使用血清的缺點

1）可能改變細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)：體內(nèi)細胞不和血清直接接觸，而體外培養(yǎng)時直接接觸，使之偏離原始狀態(tài);2）有些物質(zhì)對細胞產(chǎn)生毒性作用，如：補體，抗體，細菌毒素等;3）每批血清之間都有差別;4）取材過程有可能帶入支原體、病毒，導(dǎo)致實驗失敗。血清3、種類：1）小牛血清（10～30D）2）新生牛血清（24H）3）胎牛血清血清品質(zhì)最高4、鑒定內(nèi)容：血清質(zhì)量高低取決于：取材對象:用于制備血清的動物要健康無病，并在指定的出生天數(shù)之內(nèi)；取材過程:嚴格按照操作規(guī)程進行，并進行嚴格的質(zhì)量鑒定。1）理化性質(zhì)：蛋白含量越低越好;2）微生物檢測主要是檢測支原體和病毒;3）促生長效果。（3）吹打混勻細胞懸液加入96孔板倒置顯微鏡觀察標記出單個細胞的板孔繼續(xù)培養(yǎng)每周觀察一次三周后長出集落，每天觀察一次計算出克隆形成百分率。實驗歷時一個月！注意：選擇容易形成克隆的細胞進行實驗（原代細胞不行）！5.血清的使用和儲存1）使用前的處理：熱滅活，條件：56℃，30min目的：除去血清中補體成分，避免補體毒害細胞注意：1、血清很珍貴，每次滅活一小瓶;2、同時使用三個溫度計，不要使用溫差大的溫度計;3、熱滅活針對補體、支原體及病毒等對熱敏感的微生物，但不保證所有的微生物滅活后都死掉。2）儲存條件:-20℃，避免反復(fù)凍融，分裝使用溶解時先放4℃，完全溶解搖勻后再使用。3）使用濃度（回憶生長液，維持液？）

◎疫苗的滅活:一種被殺死的病毒,將其輸入人體內(nèi)后既不會使人染病,又可以促使人產(chǎn)生抗體抵御病毒的入侵.◎微生物的滅活:使微生物喪失活性.◎血清的滅活:除去血清中的補體成分,避免對細胞產(chǎn)生毒害作用含有鼠尾膠原的培養(yǎng)基在鼠尾膠原中生長的PC-12細胞

（三）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基又稱為基本培養(yǎng)基；加入血清后叫做完全培養(yǎng)基。

液體培養(yǎng)基

干粉培養(yǎng)基配制步驟：（1）先向滅菌的三角瓶加入三蒸水至70%-80%,并將磁棒加入;（2）加入粉狀物，用三蒸水洗袋子，直到洗至無顏色;（3）使培養(yǎng)基完全溶解（一般透明清亮為溶解好），用磁力攪

拌器攪拌30min;（4）先將NaHCO3溶解到燒杯中再緩緩加入，防止局部過堿;（5）用1mol的NaOH和HCL調(diào)整PH值（開放式培養(yǎng)）。

由于培養(yǎng)基在高壓滅菌后PH會降低0.1-0.2,過濾除菌后會升高0.1-0.2，所以調(diào)整PH值要根據(jù)實際情況調(diào)整。密閉式培養(yǎng)用NaHCO3來調(diào)整PH值;（6）過濾

滅菌后的筒式濾器上緊螺絲上口加培養(yǎng)基連雙連球，前20毫升用于做無菌檢測基礎(chǔ)培養(yǎng)基的分類：1、199培養(yǎng)基。2、低限量基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基（minimumessentialmedia，MEM）。3、DMEM（Dulbecco’smodifiedEaglemedium）：增加了各成分的用量；分高糖型和低糖型。4、IMDM（Iscove’smodifiedDulbecco’smedium）屬高糖型；適合于細胞密度低，細胞生長較困難的情況。

無血清培養(yǎng)基(serum

free

medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如：觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。

無血清培養(yǎng)基的基本配方基礎(chǔ)培養(yǎng)液HamF12和DMEM以1:1混合添加組分促貼壁物質(zhì)促生長因子及激素酶抑制劑結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白）微量元素：硒無血清培養(yǎng)基的使用方法

血清仍是動物細胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，先用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。

無蛋白培養(yǎng)基（proteinfreemedium，PFM）

無蛋白培養(yǎng)基成分簡單,僅含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、若干微量元素和乙醇胺等,故成本較低。由于它不含任何蛋白成分,故大大簡化了下游工作的流程和工藝,且容易獲得高純度的生物產(chǎn)品。目前已經(jīng)生產(chǎn)出適合于CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞株)生長的PFM；在無血清無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)Vero細胞的研究是一個熱點。(chemicaldefinedmedium，CDM）

限定化學成分培養(yǎng)基（CDM）是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的，不含動物蛋白，使用一些已知結(jié)構(gòu)和功能的小分子化合物，這更有利于分析細胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于２９３細胞(人腎上皮細胞系)，ＣＨＯ細胞，雜交瘤細胞生長的ＣＤＭ問世。1、胰蛋白酶（trypsin）溶液原理：細胞間蛋白質(zhì)水解，使細胞解離活性用消化酪蛋白的能力表示：1：125或1：250，即一份胰酶可消化１２５或２５０份的酪蛋白配置濃度：0.1%～0.25%，作用5-15分鐘；最適PH值是8～9；注意:用無鈣鎂溶液配置，如ＰＢＳ和Ｄ－Ｈank’s液,血清和鈣鎂離子均可抑制其活性.過濾除菌小包裝分裝，儲存于－２０℃如何中止胰酶消化？三、雜用液消化液2、EDTA溶液：可鏊和細胞間的鈣鎂離子，破壞細胞間連接，使細胞分離使用濃度:0.02%，配制時加堿助溶可高壓滅菌，也可過濾除菌對于帖壁特別牢的細胞，可用ＥＤＴＡ和胰酶混合液進行消化不會被血清中和，不易除去，通常不使用3、膠原酶（collagenase）溶液作用對象:膠原，對細胞溫和，損傷較小經(jīng)常用于上皮類細胞的原代培養(yǎng)使用濃度:0.1～0.3mg／ＬPH值6.5不受血清和鈣鎂離子抑制，可用Ｈａｎｋ‘ｓ和ＰＢＳ配制思考題為什么胰蛋白酶和膠原酶不能混合消化細胞？？1）碳酸氫鈉溶液

若是密閉式培養(yǎng)，則不必按說明書要求加入碳酸氫鈉，而是用碳酸氫鈉調(diào)整培養(yǎng)基ＰＨ值．若是開放式培養(yǎng)，通常先加入適量的碳酸氫鈉２．２ｇ／Ｌ，邊加邊攪拌，用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ和ＨＣｌ調(diào)整ＰＨ，過濾除菌使用．ＰＨ調(diào)整液必須用三蒸水配制！PH值調(diào)整液HEPES液是一種弱酸,能防止培養(yǎng)基PH值迅速變動,可維持PH值在7.0左右;呈橘紅色，細胞生長過程變化不大;在進行克隆化培養(yǎng)時由于長期不更換培養(yǎng)基，要加入ＨＥＰＥＳ;在開放式培養(yǎng)，觀察細胞時，培養(yǎng)基脫離了５％的ＣＯ２環(huán)境，ＣＯ２迅速逸出而使培養(yǎng)基ＰＨ升高，若加ＨＥＰＥＳ則能維持在ＰＨ７．０.2)HEPES液:十分昂貴在細胞代謝中起重要作用,在溶液中很不穩(wěn)定，