第六章人工染色體生物體的許多重要性狀牽涉到復雜的生理生化反應系列，受多基因或基因簇的控制，與成百至上萬千堿基的DNA片段相關。復雜基因組的物理作圖和基因的定位克隆也涉及到大片段DNA的研究。因此，提高載體的容納量一直是克隆載體的重要發(fā)展方向之一。隨著脈沖電泳技術的發(fā)展以及基因組研究的日益深入，對可插入大片段DNA的克隆載體——人工染色體的研究取得了迅速的發(fā)展所謂人工染色體——是一類能在生物細胞中獨立“穩(wěn)定存在和遺傳的人工重組DNA分子”。一、YAC的基本序列元件酵母染色體DNA自主復制順序（ARS）酵母染色體的著絲粒順序（CEN）酵母染色體的端粒順序（TEL）第一節(jié)YAC——酵母人工染色體YAC載體主要是用來構建大片段DNA文庫，特別用來構建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。

正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel）定位于染色體末端一段序列，用于保護線狀的DNA不被胞內的核酸酶降解，形成穩(wěn)定的結構酵母自主復制序列（ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進行雙向復制所必需的信號。

酵母著絲點(CEN)有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中。在YAC中起到保證一個細胞內只有一個人工染色體的作用。pYAC4：酵母第四條染色體的著絲粒。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態(tài)也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體，YAC載體以環(huán)狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質粒載體的復制元件和選擇標記，以便保存和增殖。二、克隆策略三、YAC克隆系統(tǒng)的特點1、YAC作為可提供大片段DNA的方法，簡化了構建染色體延伸區(qū)域圖譜和分離完整基因的過程（200～500kb，甚至1000kb）2、用酵母為宿主重新構建大的人類基因區(qū)段，可將小的重疊的YAC變成一個大的YAC3、酵母作為一種真核生物，為其它真核的DNA提供了更合適的環(huán)境四、YAC克隆系統(tǒng)的缺點首先，在YAC載體的插入片段會出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的現(xiàn)象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個YAC中的插入片段由2個或多個的獨立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5%～50%。

YAC染色體與宿主細胞的染色體大小相近，影響了YAC載體的廣泛應用。YAC染色體一旦進入釀酒酵母細胞，由于其大小與內源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利于進一步分析。返回第二節(jié)細菌人工染色體（BAC）一、BAC特點1、是以大腸桿菌的F因子的重要位點及基因為主體的高通量低拷貝的質粒載體。2、F因子的特點又稱致育因子，是一個100kb的質粒，能整合到宿主染色體中。并能高頻率的轉移遺傳標記。F因子在大腸桿菌中的復制受到嚴格控制而保持低拷貝，一般為每細胞1～2個拷貝，其parB基因能夠排斥細胞中的外源性F質粒，限制了細胞內質粒分子間的重排，降低了BAC中外源基因的重組和嵌合度二、BAC載體的結構1992年Shizuya利用F因子的復制起點和氯霉素抗性標記基因，在F質粒（pMBO131）基礎上構建了第一代BAC人工染色體。能夠克隆和保持大于100kb的DNA。新一代BAC載體為7.4kb的環(huán)狀質粒：F因子的parA，parB，parC基因以保證低拷貝的BAC質粒在大腸桿菌分裂時均勻分配到子代細胞

oriS基因：來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴謹型控制的復制子解旋酶基因－repE：一個易于DNA復制的由ATP驅動的解旋酶選擇標志基因Cmr－氯霉素抗性基因cosN—來源于λphage的cos位點，可以用λ末端酶切割BAC使之線性化NotⅠ識別序列，位點十分稀少。重組子通過NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段。用相應的酶作不完全酶切，可以獲得長度不等的DNA片段人工合成的進行末端標記的含有l(wèi)oxP序列的片段Cre酶識別loxP位點后形成的線性化的BACDNA經(jīng)PFGE電泳后進行放射自顯影，含有標記的loxP序列的片段會有條帶利用Cre/loxP直接構建外源基因的限制酶譜三、BAC優(yōu)點BAC載體的容載能力一般為100～350kb以大腸桿菌為寄主，轉化率高，構建ＢＡＣ文庫比ＹＡＣ文庫更容易ＢＡＣ載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在，BAC載體空載時大小約7.5kb，在大腸桿菌中以質粒的形式復制，具有一個氯霉素抗性基因。外源基因組DNA片段可以通過酶切、連接克隆到BAC載體多克隆位點上，通過電穿孔的方法將連接產(chǎn)物導入大腸桿菌重組缺陷型菌株。裝載外源DNA后的重組質粒通過氯霉素抗性和LacZ基因的α–互補篩選。ＢＡＣ的復制子來源于Ｆ因子，可穩(wěn)定遺傳，嵌合及重組現(xiàn)象少可以通過菌落原位雜交來篩選目的基因，方便快捷ＢＡＣ載體在克隆位點的兩側具有Ｔ7和Ｓｐ6聚合酶啟動子，可以用于轉錄獲得ＲＮＡ探針或直接用于插入片段的末端測序P1噬菌體與λ噬菌體一樣，外有蛋白質殼。內含相當大的（110～115kb）線性DNA，并在體外包裝于P1殼內。P1進入宿主細胞后環(huán)化，擴增。1994年，有人將P1和F因子克隆結合產(chǎn)生P1人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC。第三節(jié)其他的人工染色體一、P1人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC基于PAC的人類基因組文庫插入片段的大小在60kb～150kb之間。（2）自下而上的策略該策略是在細胞內或者細胞外將著絲粒ＤＮＡ、端粒ＤＮＡ以及復制起點裝配在一起，從而構建HAC。研究者應用這種策略，在ＨＴ1080細胞中得到了第一種ＨＡＣ。他們將>1Ｍｂ的人17號染色體的α衛(wèi)星ＤＮＡ、人端粒ＤＮＡ、人基因組ＤＮＡ隨機片段用脂質體共轉染ＨＴ1080細胞。經(jīng)過重組，那些同時含有著絲粒、端粒、復制起點且按照正常染色體結構順序的重組連接產(chǎn)物以染色體的形式穩(wěn)定保存下來，而那些不完整或未按照正常順序連接的產(chǎn)物因其不能穩(wěn)定地進行有絲分裂而丟失、降解。由此通過有絲分裂而自然篩選出ＨＡＣ。質粒受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8kbpUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosom