核酶抗體酶CompanyLogo核酶（Ribozyme)一、概述二、剪接型核酶三、剪切型核酶四、核酶的應用五、核酶技術面臨的問題六、脫氧核酶（deoxyribozyme)CompanyLogo1、對酶及生物催化劑的認識的發(fā)展一、概述生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質類：天然酶

enzyme極端酶extremozyme抗體酶abzyme生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質工程新酶、RibozymeDeoxyribozymeCompanyLogo3、核酶作用的特點化學本質RNA底物RNA肽鍵ā-葡聚糖分支酶反應特異性(專一性）堿基催化效率低產物CompanyLogo剪切型核酶剪接型核酶根據(jù)催化反應錘頭核酶I內含子II內含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP4.核酶的分類CompanyLogo二、剪接型核酶剪接型核酶的作用機制是通過既剪有接的方式除去內含子（Intron).剪接型核酶分類1、I類內含子2、II類內含子CompanyLogo核酶是一種金屬依賴酶金屬離子的作用：1、特異的結構作用，或參與活性部位的化學過程2、促進RNA的總體折疊3、二價金屬離子（如Mg2+）與底物活性部位直接相互作用，參與過渡中間復合物的形成CompanyLogo2、Ⅱ類內含子的自我剪接剪接機制結構與功能的關系CompanyLogo三、剪切型核酶1、自身催化剪切型RNA1、1剪切機制1、2結構與功能的關系

錘頭結構

(Hammerhead)

發(fā)夾結構(Hairpin)

斧頭結構(Axehead)

假結樣結構(Pseudoknot-like)1、3影響核酶活性的因素CompanyLogoRNaseP可剪切前體5‘端41nt,5’端成熟。不同tRNA的5’端沒有順序共同性，剪切的準確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關，表明在RNaseP的組分內沒有引導序列，RNaseP所識別的是底物的高級結構。RNaseP底物的二級結構剪切位點CompanyLogoCompanyLogo1、轉核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性內切酶作用

CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpNCompanyLogo

五、核酶技術面臨的問題1、核酶催化切割反應的可逆性問題2、提高催化效率3、尋找合適載體將核酶高效、特異地導入靶細胞4、使核酶在細胞內有調控地高效表達5、增強核酶在細胞內的穩(wěn)定性6、對宿主的損傷問題有待進一步考察CompanyLogo六、脫氧核酶的研究1、體外選擇技術篩選脫氧核酶分子脫氧核酶分子的體外選擇是通過優(yōu)先擴增事先固定在固相載體上的具有自我裂解功能的活性分子來實現(xiàn)的。通過這一技術已有兩種具有RNA裂解活性的脫氧核酶被篩選出來。8-17，10-23。2、脫氧核酶催化特征10-23裂解位點為嘌呤、嘧啶連接雙鏈穩(wěn)定性越高，酶活性越高結合臂的長度影響酶催化轉換性RNA-DNA比RNA-RNA穩(wěn)定性差。對Mg2+,Zn2+,Ca2+,Mn2+有依賴性組氨酸，精氨酸促進催化活性極強的切割特異性（單堿基錯配即可大幅降低切割活性）CompanyLogo10-23型脫氧核酶作用機理RYRRNAsubstrate切割點R=AorGY=CorUdeoxyribozyme53CompanyLogop3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類內含子的剪接機制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子內含子或居間序列（Interveningsequence,IVS)5‘CompanyLogop2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類內含子的剪接機制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接CompanyLogoBAA5‘BBABAPCRPCR5‘5‘5‘StreptavidinColumnNaOHcofactor體外選擇技術篩選具有自我裂解功能的DNA分子N50(DNA分子庫）CompanyLogoⅡ類內含子有一個保守的二級結構：結構域Ⅰ：兩個保守內含子結構序列EBS1,EBS2與兩個外顯子結構序列IBS1,IBS2互相配對。結構域Ⅴ：高度保守，催化活性必需。結構域Ⅵ：A提供2‘-OHⅡ類內含子二級結構模式5’3’CompanyLogo5個環(huán)和4個螺旋形成兩個結構域剪切反應發(fā)生在底物識別序列GUC的5‘端兩個內部環(huán)中的堿基及在螺旋區(qū)Ⅱ的G11和底物中的G+1都是酶發(fā)揮作用所必需的。5‘3‘發(fā)夾二級結構模型剪切位點CompanyLogo

mRNA剪接過程

mRNA剪接反應是在剪接體（splicesome)上進行的.5種snRNA剪接體50多蛋白質CompanyLogo錘頭結構的五種類型R示酶，S示底物，箭頭示剪切位點CompanyLogo建議的L19RNA催化機理CompanyLogo錘頭型核酶對切割位點的識別位點遵守NHH規(guī)則（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化過程需要二價金屬離子參與。單金屬離子催化雙金屬離子催化CompanyLogoCompanyLogo錘頭型核酶的二級結構和空間立體結構示意圖三個雙螺旋區(qū)13個核苷酸殘基保守序列剪切反應在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生CompanyLogoUCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲rRNA前體自我剪接反應CompanyLogoCCCUCUOP+HOG

3’OAoooCCCUCUOPOAoOGCCCUCUOH+P-oGoAoo過渡態(tài)CompanyLogoCCCUCUOPOAoOGoCCCUCUOPOAoOGMg2+Mg2+o過渡態(tài)金屬離子催化CompanyLogoCompanyLogo錘頭（Hammerhead)結構二級結構模型錘頭二級結構編號錘頭結構的類型錘頭核酶的催化反應機制CompanyLogo17位（X）的核苷酸殘基多數(shù)是C,不能是U,G.7位核苷酸殘基的置換不會對酶活性產生很大影響錘頭二級結構編號7位核苷酸17位核苷酸CompanyLogo發(fā)夾（hairpin）結構發(fā)夾核酶發(fā)現(xiàn)于三種不同植物RNA病毒，即煙草環(huán)點病毒，菊苣黃色斑點病毒型和筷子芥花葉病毒。三種發(fā)夾核酶分別是這些RNA病毒衛(wèi)星RNA的負鏈，英文縮寫分別是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均為單鏈RNA。

發(fā)夾核酶結構模型

發(fā)夾核酶催化機制金屬離子在催化反應中起結構作用，其剪切活性比錘頭結構核酶高。CompanyLogoGUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGCAUUCCGAGGGGACCAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCUUCCGCCUCAGGUAAGCG3‘5‘剪切位點HDV核酶假結樣結構ⅠⅡⅢⅣL3L4J1/2J1/4J2/4四個螺旋區(qū)，三個連接區(qū)，兩個環(huán)活性中心區(qū)：J1/4,J2/4,L3剪切位點：688/689CompanyLogo影響核酶活性的因素1、pH值對活性的影響pH7﹒0-7﹒5時核酶活性最高。2、二價金屬陽離子對活性的影響Mg2+Mn2+

3、抗生素對活性的影響大多數(shù)為抑制效應4、變形劑對活性的影響5、溫度對活性的影響在65℃范圍內隨溫度升高而增加，37℃時均有適宜的活