第七章外源基因表達(dá)第一頁(yè)，共50頁(yè)。第一節(jié)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1.原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)

與真核細(xì)胞相比，原核細(xì)胞的基因表達(dá)有以下特點(diǎn)：（1）原核生物只有一種RNA聚合酶（真核細(xì)胞有三種）識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表達(dá)是以操縱子為單位的。（3）由于原核生物無(wú)核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。（4）原核基因一般不含有內(nèi)含子，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。（5）原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對(duì)第二頁(yè)，共50頁(yè)?；虍a(chǎn)物的直接控制要慢。（6）在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子及16S核糖體RNA3’末端堿基互補(bǔ)的序列，即S-D序列，而真核基因則缺乏此序列。2.原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)

從上述特點(diǎn)可以看出，欲將外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，必須考慮表達(dá)載體、外源基因的性質(zhì)、原核細(xì)胞的啟動(dòng)子和S-D序列、閱讀框架及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，也就是說(shuō)必須滿足以下條件：（1）通過(guò)表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。（2）外源基因不能帶有內(nèi)含子，因而必須用cDNA或化學(xué)合成第三頁(yè)，共50頁(yè)。的基因，而不能用基因組DNA。（3）必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和S-D序列等調(diào)控元件控制外源基的表達(dá)。（4）外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開(kāi)放閱讀框架。（5）利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的傷害。3.原核生物基因表達(dá)的調(diào)控序列

只有在了解了原核生物基因表達(dá)調(diào)控序列的基礎(chǔ)上，才能夠構(gòu)建高效的表達(dá)載體，使外源目的基因在原核細(xì)胞中得到高效率、高水平地表達(dá)。對(duì)于原核細(xì)胞來(lái)講，基因表達(dá)的調(diào)控序第四頁(yè)，共50頁(yè)。列主要涉及啟動(dòng)子、S-D序列、終止子、增強(qiáng)子、衰減子等序列。（1）啟動(dòng)子啟動(dòng)子(promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。原核生物的啟動(dòng)子是由兩段彼此分開(kāi)且高度保守的核苷酸序列組成。■-35區(qū)（TTGACA）：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)?！?10區(qū)（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶結(jié)合于此處導(dǎo)致DNA雙鏈形成單鏈。第五頁(yè)，共50頁(yè)。原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子有l(wèi)ac（乳糖啟動(dòng)子）、trp（色氨酸啟動(dòng)子）、PL及PR（λ噬菌體左向和右向啟動(dòng)子）、tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子）等。（2）終止子在一個(gè)基因或一個(gè)操縱子的3’端往往有一個(gè)特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一段DNA序列稱為終止子（terminator)。終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C區(qū)域具有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄后的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄終止作用類型，終止子可分為兩種：依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止子及不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止子。第六頁(yè)，共50頁(yè)。（3）S-D序列S-D序列是位于起始密碼子（AUG）上游3~10bp處的由3~9bp組成的序列。這段序列正好與16SrRNA3’端序列互補(bǔ)，是rRNA的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。S-D序列存在與否及S-D序列與起始密碼子之間的距離，是影響mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的主要因素之一。（4）增強(qiáng)子增強(qiáng)子（enhancer)是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。第七頁(yè)，共50頁(yè)。4.幾種類型的原核表達(dá)載體

在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同，總的來(lái)說(shuō)可以產(chǎn)生融合型和非融合型表達(dá)蛋白。不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白稱為非融合蛋白。融合蛋白指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。（1）非融合型表達(dá)蛋白載體pKK223-3具有一個(gè)強(qiáng)的tac（trp-lac）啟動(dòng)子，這個(gè)啟動(dòng)子是由trp啟動(dòng)子的-35區(qū)、lacUV5啟動(dòng)子的-10區(qū)、操縱基因及S-D序列組成。緊接著tac啟動(dòng)子的是一個(gè)取自pUC8的多位點(diǎn)接頭，使之很容易把目的基因定位在啟動(dòng)子和S-D序列之后。第八頁(yè)，共50頁(yè)。在多位點(diǎn)下游的一段DNA序列中，還包含一個(gè)很強(qiáng)的rrnB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。載體的其余部分由pBR322組成。（2）分泌型克隆表達(dá)載體pINIII系統(tǒng)這個(gè)載體系統(tǒng)是由pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的。帶有大腸桿菌最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，即Ipp（脂蛋白基因）啟動(dòng)子。在啟動(dòng)子的下游裝有l(wèi)acUV5的啟動(dòng)子及其操縱基因，并把lac阻遏子的基因（lacI）也克隆到這個(gè)質(zhì)粒上。這樣目的基因的表達(dá)就成為可調(diào)節(jié)的了。在轉(zhuǎn)錄控制的下游再裝上人工合成的高效翻譯起始序列（S-D序列及ATG）。信號(hào)肽序列取自于大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。第九頁(yè)，共50頁(yè)。在編碼序列的下游緊接著一段人工合成的多克隆位點(diǎn)片斷，包括三個(gè)單一酶切位點(diǎn)，EcoRI、HindIII、BamHI。（3）融合蛋白表達(dá)載體pGEX系統(tǒng)載體的組成成分基本上與其它表達(dá)載體相似，含有啟動(dòng)子tac及l(fā)ac操縱基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。這類載體與其它表達(dá)載體不同之處在于S-D序列下游是谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因，而克隆的外源基因則與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶基因相連。當(dāng)進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和目的基因產(chǎn)物的融合蛋白。第十頁(yè)，共50頁(yè)。5.外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)部位

（1）不同表達(dá)部位克隆在大腸桿菌中的外源基因，它們的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)，有的是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，有的是在細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)，還有的則是以分泌到細(xì)胞外的方式表達(dá)。■細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的外源蛋白，大多是以包含體的形式存在的。包含體是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)?！鲋苜|(zhì)中表達(dá)周質(zhì)是指在大腸桿菌一類格蘭氏陰性細(xì)菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。周質(zhì)中表達(dá)的蛋白需要在信號(hào)肽的引第十一頁(yè)，共50頁(yè)。導(dǎo)下才能穿越內(nèi)膜，進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)?！黾?xì)胞外表達(dá)表達(dá)的外源蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，同樣需要信號(hào)肽序列的引導(dǎo)。（2）不同部位表達(dá)外源蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)第十二頁(yè)，共50頁(yè)。表達(dá)部位優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)1、形成包涵體（a）蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度的方式分離（b）蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用（c）蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，因此不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害2、蛋白質(zhì)產(chǎn)量高3、表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單1、形成包涵體（a）蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無(wú)法恢復(fù)其生物學(xué)活性（b）蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低（c）蛋白質(zhì)生產(chǎn)成本比較昂貴2、還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成3、由于N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白質(zhì)的真實(shí)性受到影響4、蛋白質(zhì)會(huì)被降解5、蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復(fù)雜周質(zhì)1、由于周質(zhì)中蛋白種類比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡(jiǎn)單2、蛋白質(zhì)降解的程度不甚嚴(yán)重3、促進(jìn)了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用4、蛋白質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)真實(shí)1、信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)2、有可能形成包涵體胞外1、蛋白質(zhì)的降解作用程度最低2、由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)容易純化3、增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用4、蛋白質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)真實(shí)1、在大腸桿菌中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去的2、由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化過(guò)程比較復(fù)雜表7.1不同部位表達(dá)外源蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)第十三頁(yè)，共50頁(yè)。6.影響外源基因表達(dá)效率的因素及提高表達(dá)水平常用的方法

（1）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響原核生物啟動(dòng)子有兩種保守序列，即-35區(qū)的TTGACA序列和-10區(qū)的TATAAT序列。研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子的強(qiáng)度與一致序列的相似程度成正比。進(jìn)一步的研究表明，-35和-10區(qū)的距離也是一個(gè)重要因素。如果間隔為17個(gè)堿基對(duì)，啟動(dòng)子表現(xiàn)很強(qiáng)，如果大于17個(gè)堿基對(duì)，啟動(dòng)子表現(xiàn)較弱。根據(jù)這些原理，Amann等克隆了tac啟動(dòng)子（lac-trp），促進(jìn)了克隆基因的表達(dá)。（2）轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響第十四頁(yè)，共50頁(yè)。S-D序列的保守性、S-D序列后面的4個(gè)堿基成分以及起始密碼子AUG左側(cè)的密碼三聯(lián)體的堿基組成都會(huì)影響到外源基因的表達(dá)效率。如：UAAGGAGG比GGAGG高3～6倍（表達(dá)水平)SD與AUG間富含AT有利于翻譯AUG左側(cè)的密碼三聯(lián)體為UAU或CUU時(shí)，轉(zhuǎn)譯最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時(shí)，轉(zhuǎn)譯水平將下降20倍。（3）啟動(dòng)子同克隆基因間的距離對(duì)表達(dá)效率的影響啟動(dòng)子同克隆基因間的距離對(duì)表達(dá)效率的影響，主要是由于mRNA的5’末端形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響mRNA的翻譯效率。根據(jù)上述原理，要提高克隆基因的表達(dá)效率，可采用構(gòu)建克第十五頁(yè)，共50頁(yè)。隆庫(kù)的辦法。在庫(kù)中，將外源基因分別放置在離啟動(dòng)子遠(yuǎn)近不同的地方。轉(zhuǎn)化后，篩選重組克隆，從中篩選出外源基因表達(dá)最強(qiáng)的克隆。（4）轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響克隆基因的末端是否存在轉(zhuǎn)錄終止區(qū)也會(huì)影響到克隆基因的表達(dá)效率。其原因可能為：若干非必須的轉(zhuǎn)錄本的合成，會(huì)使細(xì)胞消耗巨大的能量用于制造大量非必須的蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)錄本上有可能出現(xiàn)一些不期望出現(xiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而降低了轉(zhuǎn)譯的效率。因此，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，在克隆基因后面安裝一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄第十六頁(yè)，共50頁(yè)。終止子（如rrnB終止子）對(duì)完全終止轉(zhuǎn)錄是必要的，可以阻止通讀，增加基因表達(dá)。（5）質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響由于細(xì)胞中的核糖體數(shù)量，與任何一種mRNA分子數(shù)目相比，都是大大超量的，因此，提高克隆基因表達(dá)效率的途徑之一，是增加相應(yīng)的mRNA分子數(shù)量。為此，須增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)及其穩(wěn)定性。一般采用松弛型質(zhì)粒構(gòu)建外源基因的表達(dá)載體，從而達(dá)到增加質(zhì)粒及外源基因拷貝數(shù)的目的。質(zhì)粒載體中含有分配功能區(qū)par，能保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中都能準(zhǔn)確地進(jìn)行分離，并均等地分配到子代細(xì)胞中去，從而達(dá)到穩(wěn)定質(zhì)?？截悢?shù)的作用。第十七頁(yè)，共50頁(yè)。（6）mRNA的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響原核生物的mRNA分子的降解速度很快，一般在幾秒~幾分之間。因此，維持外源基因mRNA的穩(wěn)定性可提高其表達(dá)效率。一般的作法是給外源基因mRNA的5’及3’端安裝某些結(jié)構(gòu)序列，保護(hù)mRNA不能被降解。如：3’端莖環(huán)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)；E.coliompA轉(zhuǎn)錄物的5’非翻譯部分可作為mRNA的穩(wěn)定劑。（7）遺傳密碼子的使用對(duì)表達(dá)效率的影響無(wú)論是真核基因還是原核基因，一種特定的氨基酸并不是以等同的頻率使用所有的同義密碼子，而是使用其中的某一兩種。我們將這種遺傳密碼子使用的非隨機(jī)性現(xiàn)象，稱為密碼子使用偏愛(ài)性，簡(jiǎn)稱密碼子偏愛(ài)性。第十八頁(yè)，共50頁(yè)。選擇和使用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子有利于增加外源基因在大腸桿菌中的翻譯效率，從而提高外源基因的表達(dá)效率。（8）寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)基因表達(dá)效率的影響大腸肝菌寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)，會(huì)或多或少地影響外源基因的表達(dá)效率，諸如：培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)的方式，以及培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)基中所溶解的氧的數(shù)量等環(huán)境參數(shù)。不過(guò)，有關(guān)處于不同生理狀態(tài)下的大腸桿菌寄主細(xì)胞，究竟是怎樣影響外源基因的細(xì)胞效率的，人們?cè)谶@方面的知識(shí)還是相當(dāng)貧乏的。第十九頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.1原核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列

第二十頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.2原核基因轉(zhuǎn)錄的起始

第二十一頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.3原核基因終止子序列及其結(jié)構(gòu)

第二十二頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.4非融合型表達(dá)蛋白載體pKK223-3第二十三頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.5分泌型克隆表達(dá)載體pINIII系統(tǒng)第二十四頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.6融合蛋白表達(dá)載體pGEX系統(tǒng)第二十五頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.74個(gè)天然啟動(dòng)子和兩個(gè)人造啟動(dòng)子的-35區(qū)和-10區(qū)的堿基序列第二十六頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.8三個(gè)重組質(zhì)粒的cromRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)第二十七頁(yè)，共50頁(yè)。圖7.9改變Lac啟動(dòng)子和克隆基因間距離的一般方法第二十八頁(yè)，共50頁(yè)。第二節(jié)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)1.酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母（yeast）是一類以芽殖或裂殖進(jìn)行無(wú)性繁殖的單細(xì)胞真核生物，是最理想的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。（1）酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制比較清楚，遺傳操作相對(duì)簡(jiǎn)便。具有原核生物所不具備的蛋白質(zhì)翻譯后的加工和修飾系統(tǒng)?？蓪⑼庠椿虮磉_(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。對(duì)人體和環(huán)境安全，不含毒素和特異性病毒?？蛇M(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵，工藝簡(jiǎn)單而成熟，成本低廉。第二十九頁(yè)，共50頁(yè)。（2）酵母基因表達(dá)載體酵母克隆和表達(dá)載體是由酵母野生型質(zhì)粒、原核生物質(zhì)粒載體上的功能基因（如抗性基因、復(fù)制子等）和宿主染色體DNA上的自主復(fù)制子結(jié)構(gòu)（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（LEL）等一起構(gòu)建而成。酵母基因表達(dá)系統(tǒng)的載體一般是一種穿梭質(zhì)粒，它既能夠在原核細(xì)胞（大腸桿菌）中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞（酵母）中復(fù)制?！鯠NA復(fù)制起始區(qū)a：大腸桿菌源質(zhì)粒的復(fù)制起始序列：使其能在大腸桿菌中復(fù)制。b：酵母菌的天然2μ質(zhì)粒的復(fù)制起始序列或酵母基因組中的自主復(fù)制序列，使其能在酵母菌中復(fù)制。第三十頁(yè)，共50頁(yè)?！鲞x擇標(biāo)記基因a：營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記，宿主菌為相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。b：顯性選擇標(biāo)記（G418等），可采用各種類型酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞?！鲇薪z分裂穩(wěn)定區(qū)

來(lái)源于酵母染色體著絲粒（centromere）片斷，能保證表達(dá)載體在酵母細(xì)胞分裂時(shí)，能平均地分配到子代細(xì)胞中去?！霰磉_(dá)盒

表達(dá)盒是酵母表達(dá)載體的重要元件，包括啟動(dòng)子、分泌信號(hào)肽序列、多克隆位點(diǎn)及終止子序列。啟動(dòng)子：保證轉(zhuǎn)錄的起始。分泌信號(hào)肽序列：引導(dǎo)目的基因蛋白分泌到細(xì)胞外。第三十一頁(yè)，共50頁(yè)。多克隆位點(diǎn)：供外源基因插入。終止子：保證轉(zhuǎn)錄在適當(dāng)位置停止。（3）酵母基因表達(dá)載體的種類■自主復(fù)制型質(zhì)粒載體該質(zhì)粒含有酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記、基因克隆位點(diǎn)等關(guān)鍵元件。酵母基因組DNA復(fù)制起始區(qū)：能夠在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制?；蚩寺∥稽c(diǎn)：來(lái)源于大腸桿菌源質(zhì)粒，如pBR322。這類載體的優(yōu)點(diǎn)在于：在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化率高，每個(gè)細(xì)胞拷貝數(shù)可達(dá)200個(gè)缺點(diǎn)在于：由于缺乏酵母染色體著絲粒片斷，在細(xì)胞分裂過(guò)程中不能均勻的分配到子細(xì)胞中去，因而經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)后，子細(xì)第三十二頁(yè)，共50頁(yè)。胞中質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)迅速減少?！稣闲唾|(zhì)粒載體該質(zhì)粒載體不含有酵母DNA復(fù)制起始區(qū)，不能在酵母中進(jìn)行自主復(fù)制，但該質(zhì)粒含有整合介導(dǎo)區(qū)，可以通過(guò)DNA的同源重組將外源基因整合到酵母染色體上，隨染色體一起進(jìn)行復(fù)制?！鲋z粒型質(zhì)粒載體該質(zhì)粒載體是在自主復(fù)制型質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件（著絲粒），因而能保證質(zhì)粒載體在細(xì)胞分裂時(shí)平均地分配到子細(xì)胞中去，同時(shí)提高了質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性?！鼋湍溉斯と旧w第三十三頁(yè)，共50頁(yè)。（4）酵母基因表達(dá)系統(tǒng)宿主菌目前，作為外源基因表達(dá)的宿主酵母菌主要包括：釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、乳酸克努維酵母和多形漢森酵母。（5）在酵母中高效表達(dá)外源基因的策略■提高表達(dá)載體在細(xì)胞中的拷貝數(shù)以多拷貝酵母內(nèi)源性質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的多拷貝表達(dá)載體，是提高表達(dá)載體在酵母中拷貝數(shù)的一個(gè)途徑。但以上的多拷貝載體在沒(méi)有選擇壓力的情況下，可能難以保持其高拷貝數(shù)。將外源基因整合到染色體上可維持外源基因在細(xì)胞中的穩(wěn)定性，然而在多數(shù)情況下會(huì)因?yàn)樵诩?xì)胞中的拷貝數(shù)較低而影響其表達(dá)。第三十四頁(yè)，共50頁(yè)?！鎏岣咄庠椿虻霓D(zhuǎn)錄水平在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)組入強(qiáng)啟動(dòng)子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因啟動(dòng)子、甘油醛磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子，可提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。但外源基因表達(dá)的產(chǎn)物量過(guò)高也會(huì)對(duì)細(xì)胞形成傷害?！鲞x擇合適的受體細(xì)胞系統(tǒng)根據(jù)表達(dá)載體特性，選擇合適的酵母受體系統(tǒng)。第三十五頁(yè)，共50頁(yè)。2.植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)

（1）植物基因表達(dá)載體的組成特性大多數(shù)植物基因表達(dá)載體是以Ti質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的，其組成包括啟動(dòng)子、T-DNA、終止子、內(nèi)含子及選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因?！鲋参锘虮磉_(dá)載體的啟動(dòng)子根據(jù)啟動(dòng)子的功能和作用方式，可分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子等幾類。組成型啟動(dòng)子：外源基因的表達(dá)大體恒定在一定水平，在不同組織部位沒(méi)有明顯差異，沒(méi)有時(shí)空特異性。一般采用花椰菜花葉病毒（CaMV）35SRNA的啟動(dòng)子、Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因(nos)或章魚(yú)堿合成酶基因(ocs)的啟動(dòng)子。第三十六頁(yè)，共50頁(yè)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)刺激下，可大幅度提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。組織特異型啟動(dòng)子：外源基因只能在特定的組織細(xì)胞中表達(dá)。如：采用馬鈴薯塊莖蛋白基因的啟動(dòng)子、花粉特異表達(dá)基因啟動(dòng)子等?！鲋参锘虮磉_(dá)載體的終止子不同來(lái)源的終止子對(duì)外源基因的表達(dá)有很大影響，它不僅決定外源基因的轉(zhuǎn)錄活性，也決定mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性，從而影響mRNA的翻譯。研究表明，采用相同的啟動(dòng)子及外源基因，而采用不同的終止子序列，外源基因的表達(dá)水平有很大差異（差異可達(dá)60倍）?！鯰-DNA（transferDNA）第三十七頁(yè)，共50頁(yè)。可將外源基因連入T-DNA區(qū)域，隨T-DNA隨機(jī)整合進(jìn)入植物細(xì)胞的染色體基因組中，從而使外源基因得到穩(wěn)定維持和表達(dá)。但必須注意保留T-DNA序列的左右邊界序列，因?yàn)樽笥疫吔缧蛄惺峭庠碊NA轉(zhuǎn)移和整合不可缺少的元件。■內(nèi)含子序列研究表明，內(nèi)含子與基因表達(dá)水平有很大關(guān)系。因而在構(gòu)建植物基因表達(dá)載體時(shí)，可根據(jù)不同基因的類型，有選擇性的插入內(nèi)含子序列。■選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的作用在于篩選轉(zhuǎn)化體，檢測(cè)外源基因的轉(zhuǎn)譯水平。常用的選擇標(biāo)基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等；報(bào)告基因有冠癭堿基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等。第三十八頁(yè)，共50頁(yè)。（2）植物基因表達(dá)的受體系統(tǒng)植物基因表達(dá)的受體系統(tǒng)是指用于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，主要包括以下五類：■愈傷組織再生系統(tǒng)它是外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷組織并通過(guò)分化培養(yǎng)獲得再生植株的受體系統(tǒng)。特點(diǎn)：易于接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高；擴(kuò)繁量大，可獲得大量的轉(zhuǎn)化植株；但獲得的再生植株無(wú)性系變異較大；外源基因的穩(wěn)定性差?！鲋苯臃只偕到y(tǒng)它是指外植體細(xì)胞不經(jīng)脫分化階段而直接分化出不定芽而獲得再生株。第三十九頁(yè)，共50頁(yè)。特點(diǎn)：獲得再生植株的周期短，細(xì)胞無(wú)性系變異小，能較好地保持受體細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性；但轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，存在較多的嵌合株?！鲈|(zhì)體再生系統(tǒng)特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高，可形成基因型一致的細(xì)胞克??；但原生質(zhì)體培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、難度大、再生頻率較低，在原生質(zhì)體的培養(yǎng)過(guò)程中易造成變異?！雠郀铙w再生系統(tǒng)它是指體細(xì)胞或單倍體細(xì)胞在組織培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)成為形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的胚狀體，是一種最理想的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高；獲得嵌合體少；可生產(chǎn)人工種子。第四十頁(yè)，共50頁(yè)。■生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉、卵細(xì)胞等作為基因轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)將生殖細(xì)胞誘導(dǎo)成為胚性細(xì)胞或愈傷組織，或直接利用花粉和卵子受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高；易于獲得穩(wěn)定的遺傳，并且通過(guò)加倍后成為純合的二倍體。（3）提高外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)效率的策略■構(gòu)建高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化載體■防止外源基因失活■優(yōu)化先導(dǎo)序列，提高翻譯效率第四十一頁(yè)，共50頁(yè)。3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)

（1）哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體的組成特性哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體一般包括：■在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄的元件，即轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、終止子、poly(A)信號(hào)和內(nèi)含子剪接信號(hào)。

啟動(dòng)子：主要來(lái)源于病毒，如：SV40的早期和晚期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、腺病毒晚期啟動(dòng)子等。也可選用某些真核基因的啟動(dòng)子，如：鼠細(xì)胞的金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子（可達(dá)到誘導(dǎo)表達(dá)的目的）等。

終止子和poly（A）：常用的poly（A）及終止子信號(hào)來(lái)自SV40。第四十二頁(yè)，共50頁(yè)。

內(nèi)含子剪接信號(hào)：如果采用cDNA，沒(méi)有內(nèi)含子，因而也不需要相應(yīng)的內(nèi)含子序列。如果采用基因組DNA，需要內(nèi)含子剪接信號(hào)將相應(yīng)的內(nèi)含子去除。剪接點(diǎn)之間的距離及剪接點(diǎn)周圍的序列會(huì)影響到剪接效果。同時(shí)，基因中組入一個(gè)合適的內(nèi)含子有時(shí)會(huì)提高外源基因的表達(dá)水平?！鲇糜诤Y選轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記基因

一般采用胸苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等作為哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選標(biāo)記基因?！鲈诩?xì)菌中進(jìn)行復(fù)制和篩選的元件使表達(dá)載體能夠在原核細(xì)胞中進(jìn)行大量復(fù)制，經(jīng)篩選獲得陽(yáng)性克隆子，后者經(jīng)大量培養(yǎng)可提取出大量含外源基因的表達(dá)載體，最后用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞。第四十三頁(yè)，共50頁(yè)?！龌虮磉_(dá)的調(diào)控元件

如：增強(qiáng)子可提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平，而衰減子的作用恰恰相反，降低了外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。（2）哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體■不帶真核復(fù)制起始序列的質(zhì)粒型載體

該類載體只含原核復(fù)制子，質(zhì)粒載體被轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞后不能以附加體的形式復(fù)制，而是被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并在基因組的調(diào)控