植物基因工程原理第二章DNA重組技術(shù)Chapter2DNARecombinationTechnology

DNA重組技術(shù)又稱(chēng)為基因工程（geneengineering）或分子克隆(molecularcloning)。是指通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，最終將一個(gè)生物體中的遺傳信息(DNA)轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體。1973年由美國(guó)加利福尼亞的S.Cohen和N.Boyer首次完善DNA重組，并得到驗(yàn)證。植物基因工程原理第二章

重組DNA技術(shù)西南大學(xué)西南大學(xué)①載體和目的基因的分離；②載體和目的基因的酶切；③載體和目的基因的重組；④重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增；⑤重組DNA的篩選和鑒定。西南大學(xué)西南大學(xué)§2常用工具酶構(gòu)建重組的DNA分子時(shí)，需要對(duì)DNA分子進(jìn)行切割、修飾和連接等一系列操作，離不開(kāi)酶。在DNA生化特性分析、基因的結(jié)構(gòu)分析和基因的表達(dá)調(diào)控研究中，都需要高度純化的酶。西南大學(xué)西南大學(xué)依酶催化反應(yīng)的類(lèi)型分為4大類(lèi)：核酸酶：用于切割或降解核酸分子。連接酶：用于連接核酸分子。聚合酶：用于合成核酸分子。修飾酶：用于給核酸分子加上或減去某些化學(xué)基團(tuán)或核苷酸這4種酶大都是從細(xì)菌和噬菌體中純化的。在細(xì)胞中它們?cè)揪蛥⑴cDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、降解外來(lái)DNA分子、修飾突變的DNA分子、DNA分子間的重組等一系列重要的生命反應(yīng)過(guò)程。西南大學(xué)西南大學(xué)一、核酸酶（nuclease)凡是能水解核酸的酶都稱(chēng)為核酸酶。核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)降解RNA分子成核苷酸。用于清除DNA制備物中的污染的RNA分子，如RNaseA,B;RNaseH等。降解DNA分子成核苷酸。核酸外切酶(exonuclease)3’5’:如E.coli外切酶III,3’5’和5’3’:如Bal31,非限制性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶(endonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶)(Restrictionendonuclease)在DNA分子內(nèi)部、不識(shí)別特定的序列、任意位置、隨即切割。如S1內(nèi)切酶—切單鏈DNA或雙鏈上缺刻處的單鏈，牛胰腺DNAI—切割單鏈和雙鏈DNA具有識(shí)別特定DNA序列的特性。沒(méi)有限制酶就沒(méi)有基因工程西南大學(xué)西南大學(xué)限制性?xún)?nèi)切酶

(Restrictionendonuclease)類(lèi)型II:識(shí)別位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)一致，具特異性。

單體酶，性質(zhì)穩(wěn)定，Mg2+為輔助因子。目前已分離了數(shù)百種。類(lèi)型I:識(shí)別的DNA序列長(zhǎng)約十幾個(gè)bp;酶切位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)1000kb左右，非特異性;復(fù)合酶，可在雙鏈上甲基化，同時(shí)具有限制和修飾功能，需ATP,Mg2+等S-腺苷甲硫氨酸為輔因。如EcoB,EcoK。類(lèi)型Ⅲ:酶切位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)附近或相鄰位置，非特異性。單體酶，如HgaI:GACGCnnnnn西南大學(xué)西南大學(xué)1.類(lèi)型II限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)①類(lèi)型IIRE一般都很穩(wěn)定，只需Mg+2作為輔助因子，因此，加0.5Mol/LEDTA絡(luò)合,可終止反應(yīng)。識(shí)別序列的長(zhǎng)短不一4bp:GATCSau3A(Staphylococcusaureus3A)TCGATaqI(Thermusaquoticus)5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,……32bp…②識(shí)別序列具有回文結(jié)構(gòu)。

EcoRIGAATTCCTTAAG西南大學(xué)西南大學(xué)類(lèi)型II限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)③酶切后末端有3種GAGCTCCTCGAGEcl136IIGAGCTCCTCGAG平端(bluntterminus)粘端(stick/cohesiveterminus)5’突出末端3’突出末端GAATTCCTTAAGEcoRIGAATTCCTTAAGCTGCAGGACGTCPstICTGCAGGACGTC西南大學(xué)西南大學(xué)類(lèi)型II限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)④酶識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)對(duì)稱(chēng)識(shí)別序列不對(duì)稱(chēng)識(shí)別序列CCAGGGGTCCEcoRIIGAATTCCTTAAGEcoRICCAGGGGTCCGGTCCCCAGGCCAGGGGTCCCCAGGGGTCCGGACCCCTGGGGTCCCCAGGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG西南大學(xué)西南大學(xué)類(lèi)型II限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)⑤同裂酶：⑥同位異裂酶有些酶識(shí)別位點(diǎn)相同，但切割位點(diǎn)不同HindIII和HsuIAAGCTTTTCGAAGAGCTCCTCGAGSacI和SstIGAGCTCCTCGAGSacIGAGCTCCTCGAGEcl136IISmaICCCGGGXmaICCCGGG西南大學(xué)西南大學(xué)類(lèi)型II限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)⑦同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同，但切割后產(chǎn)生相同末端BamHIGGATCCBglIIAGATCTBclITGATCASau3AGATCGATC可以用不同的酶，切出相同的粘性末端，便于重組，但重組后不能再被該酶切開(kāi)。西南大學(xué)西南大學(xué)對(duì)一個(gè)特定的RE,在一個(gè)已知列的DNA上的酶切位點(diǎn)序數(shù)目可以用數(shù)學(xué)方法來(lái)推算或預(yù)測(cè)。如：Sau3AGATC4n=44=256bp,即每256個(gè)堿基對(duì)可能出現(xiàn)一個(gè)Sau3A酶切位點(diǎn)。GGNCC4n=45=1025bpAGATCT4n=46=4096bp該公式建立在2個(gè)假設(shè)上，（1）核苷酸隨即排列，（2）四個(gè)核苷酸含量相同。西南大學(xué)西南大學(xué)溫度：標(biāo)準(zhǔn)溫度為37℃，但SmaI為30℃，TaqI為65℃2.限制酶酶切DNA的條件緩沖系統(tǒng)(Buffer)：Tris-Cl離子種類(lèi)和濃度：Mg+2為輔因，Na+或K+

DNA樣品的純度：污染有酚、氯仿、SDS、蛋白時(shí)酶切難酶穩(wěn)定劑：DTT(二硫蘇糖醇)、-巰基乙醇

DNA的甲基化程度非最適時(shí)，酶識(shí)別特異性降低，表現(xiàn)為松弛的專(zhuān)一性，此現(xiàn)象為該酶的星活性(Staractivity)，即出現(xiàn)正常酶切位點(diǎn)之外的“額外”酶切活性。緩沖系統(tǒng)(Buffer)離子種類(lèi)和濃度西南大學(xué)西南大學(xué)酶切反應(yīng)體系和操作步驟（1）加樣（2）混勻，瞬間離心；（5）電泳分析，1.2%Agrose平板電泳，3～5V/cm,（3）37℃，2～2.5h；（4）65℃15min或0.5MEDTA或-20℃放置，終止酶反應(yīng)。但HpaI,PvuI和TaqI65℃不能鈍化酶。ddH2O:加水至20l10xBuffer:2lDNA樣品：nlRE酶(10U/l)：mlTotal:20lOr:50l

100l西南大學(xué)西南大學(xué)RE酶切注意事項(xiàng)RE的1單位酶活性是指在最適溫度和緩沖體系條件下1h酶切1gλDNA的活性。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)可作為決定加入酶量的依據(jù).RE通常保存在50%甘油的貯存Buffer中，而甘油在RE反應(yīng)體系中超過(guò)5%時(shí)就表現(xiàn)出抑制。故酶切反應(yīng)時(shí)加入酶量不能超過(guò)反應(yīng)體系的1/10。注意雙酶切。酶切時(shí)間與DNA純度和用量，及酶濃度有關(guān)。如果DNA樣品是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因組DNA,酶切時(shí)間可延至18h,而PlasmidDNA的酶切時(shí)間較短。長(zhǎng)時(shí)間切要注意酶切體積的變化。若電泳分析時(shí)嫌酶切產(chǎn)物的體積過(guò)大，則可先用乙醇沉淀濃縮DNA，再電泳。

西南大學(xué)西南大學(xué)二、連接酶T4DNAligase:連接粘端和平端，缺刻E.coliDNAligase:連接粘端缺刻T4RNAligase:作用于單鏈的RNA之間，單鏈的DNA之間，單鏈的RNA和DNA之間。不連接單鏈西南大學(xué)西南大學(xué)T4DNAligase:連接粘端和平端、缺刻，不連接單鏈。最佳連接溫度為37℃，但實(shí)際上，該溫度下粘端DNA分子形成的配對(duì)極不穩(wěn)定（因氫建作用力弱）。因此，連接溫度采用12-16℃。有的公司推薦20℃。如果連接點(diǎn)的C+G含量高，如SmaI位點(diǎn)，CCCGGG，可適當(dāng)提高溫度以助連接。

西南大學(xué)西南大學(xué)三、聚合酶（polymerase）E.coliDNApolymeraseIRNApolymerase:SP6、T3、T7DNApolymeraseKlenowfragmentT4DNApolymeraseT7DNApolymeraseTaqDNApolymerasePfuDNApolymeraseTaqplusIDNApolymeraseReverseTranscriptase:AMV,M-MuLV依賴(lài)DNA西南大學(xué)西南大學(xué)5’1.DNA聚合酶以DNA為模板，催化合成互補(bǔ)的新鏈。多數(shù)需要一個(gè)引物。(1)E.coliDNApolymeraseI催化5’3’的DNA新鏈合成，同時(shí)具有5’3’的核酸外切酶活性，使DNA降解；有3’5’外切酶活性，使其具有校正功能。5’3’5’3’3’5’舊鏈被置換，在DNA標(biāo)記中常用。西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶(4)T7DNAPolymerase由2個(gè)亞基組成；催化新鏈合成；具有3’5’對(duì)單鏈和雙鏈起作用的外切酶活性。西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶(5)TaqDNAPolymerase(Taq酶)具有耐95℃左右高溫達(dá)30min以上的特性；催化5’3’的DNA新鏈合成，最適溫度68～72℃，合成速度1200bases/min；

在合成的DNA鏈的3’端常多一個(gè)“A”；不具3’5’的外切酶活性,即無(wú)校正功能，大約每合成500個(gè)堿基要錯(cuò)配一個(gè)；

具微弱的5’3’的DNA外切酶活性。5’5’3’AAAPCR用，有野生型和重組的西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶(6)Pfu

高保真DNAPolymerase具有耐95℃左右高溫達(dá)30min以上的特性；催化5’3’的DNA新鏈合成，最適溫度68～72℃，合成速度600bases/min；

合成的DNA為平端,TA克隆時(shí)要用Taq酶加A；

合成的DNA片段長(zhǎng)度在2kb以?xún)?nèi)；具3’5’的外切酶活性,即有校正功能；無(wú)5’3’的DNA外切酶活性。西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶(7)TaqPlusIDNAPolymerase具有耐95℃左右高溫達(dá)30min以上的特性；催化5’3’的DNA新鏈合成，68～72℃最適；

合成速度800bases/min；

可合成2-3kb的長(zhǎng)DNA片段；合成的DNA為平端,TA克隆時(shí)要用Taq酶加A；

具3’5’的外切酶活性,有很強(qiáng)的校正功能，大約每合成1.6x106個(gè)堿基要錯(cuò)配一個(gè)；

具微弱的5’3’的DNA外切酶活性。西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶(8)逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase)均來(lái)源于RNA病毒。以RNA為模板，需引物，合成互補(bǔ)的DNA鏈。AAAATTTTAMV:禽源RT,來(lái)源于雞成髓細(xì)胞增多癥病毒(AvianMyeloblastosisvirus)最適溫度42℃；以RNA、DNA或RNA∶DNA雜分子為模板；需引物；需Mg2+或Mn2+為輔助因子；具有很強(qiáng)的RNaseH活性，特異性地對(duì)RNA∶DNA雜分子中的RNA降解。西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶(8)逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase)M-MuLV:鼠源RT,來(lái)源于鼠白血病病毒(Moloney

MurineLeukemiaVirus)最適溫度42℃,以RNA、DNA或RNA∶DNA雜分子為模板，需引物，需Mg2+或Mn2+為輔助因子，具有RNaseH活性，特異性地對(duì)RNA∶DNA雜分子中的RNA降解。西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶AMV和M-MuLV具有RNaseH酶活性，故合成的cDNA不是全長(zhǎng)的。TTTTNaOHTTTTTTTTS1RNaseHTTTTAAAATTTTAAAAAAAAE.coliDNAPolI西南大學(xué)西南大學(xué)1.DNA聚合酶PowerscriptReverseTranscriptase

AAAACCCTTTTAAAACCCTTTTGGGAAAACCCTTTTGGGGGGCCCTTTTRNaseHCLONETECH公司的專(zhuān)利產(chǎn)品，源于M-MuLV的一個(gè)點(diǎn)突變。無(wú)RNaseH活性，故合成的cDNA不會(huì)因此變短。

具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，傾向加3個(gè)“C”。

用于合成全長(zhǎng)cDNA。GGGCCCTTTTRTase西南大學(xué)西南大學(xué)2.RNA聚合酶RNApolymerase:合成RNA。SP6RNApolymerase:識(shí)別SP6phage啟動(dòng)子Seq.T3RNApolymerase:識(shí)別T3phage啟動(dòng)子Seq.T7RNApolymerase:識(shí)別T7phage啟動(dòng)子Seq.用途:體外合成mRNA用作探針，進(jìn)行Northern雜交體外無(wú)細(xì)胞翻譯，合成蛋白質(zhì)西南大學(xué)西南大學(xué)西南大學(xué)西南大學(xué)pGEM?-11Zf(+)Vectorpromoterandmultiplecloningsitesequence西南大學(xué)西南大學(xué)四、其它工具酶1.T4polynucleotidekinase2.PhosphataseBacterialAlkalinePhosphatase

CalfIntestineAlkalinePhosphatase

3.TerminalDeoxynucleotidyltransferase4.甲基化酶

5.RNaseH6.RNaseA7.S1nuclease8.DNA松弛酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶)西南大學(xué)西南大學(xué)1.T4polynucleotidekinase5’OH

OH

P

P

5’3’3’5’OH

OH

5’3’3’OH

OH

T4polynucleotidekinaseATP5’OH

OH

P

P

5’3’3’5’kinase,對(duì)RNA、DNA5’OH基起作用，加磷酸(PO43-)基團(tuán).具3’磷酸酶(3-phosphotase)活性，去3’磷酸基團(tuán)。T4polynucleotidekinase,3-phosphotaseminusT4多核苷酸激酶西南大學(xué)西南大學(xué)2.Phosphatase磷酸酶BacterialAlkalinePhosphatase（BAP）CalfIntestineAlkalinePhosphatase(CIAP)5’OH

OH

5’3’3’OH

OH

5’OH

OH

P

P

5’3’3’來(lái)源于E.colistrainC4不易失活，活性較低不常用。功能：催化RNA、DNA5’端游離磷酸基團(tuán)水解脫落用途：去5’端磷酸基團(tuán)，防基因重組時(shí)相同末端連接，尤其用于防止Vector自環(huán)化。來(lái)源于小牛小腸，活性高，常用。西南大學(xué)西南大學(xué)3.TerminalDeoxynucleotidyltransferase末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶dGTPGGGGGGGGGGG不可逆地加入同聚物加尾，用于基因重組時(shí)產(chǎn)生粘性末端。DNA西南大學(xué)西南大學(xué)4.甲基化酶

有多種甲基化酶。

對(duì)DNA甲基化dam---GATC---Sau3AIBclI,BamHICH3dcm-CCAGG-或-CCTGGCH3CH31st的C5引入甲基高等植物染色體的甲基化程度遠(yuǎn)比細(xì)菌等低等生物的高。西南大學(xué)西南大學(xué)5.RNaseH功能：特異性地降解RNA:DNA雜交鏈中的RNA分子。用途：cDNA合成中（1）降解RNA:DNA雜交鏈中的RNA分子，便于cDNA第二鏈置合成；（2）在RNA:DNA雜交鏈中的RNA上隨即產(chǎn)生缺刻，便于cDNA第二鏈置換法合成。西南大學(xué)西南大學(xué)6.RNaseA常用于清除DNA提取物中混雜的RNA。Note:boiling5mintoremoveDNase.西南大學(xué)西南大學(xué)7.S1nuclease功能：切單鏈DNA成單個(gè)寡核苷酸。切雙鏈DNA分子中的缺口(gap)平端AAAAAAAATTTTTT--AAAAAAAATTTTTT--AMVRTase堿E.coliDNA聚合酶ITTTTTT--S1DNA^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^mRNAAMVRTaseTTTT--變性、退火S1分析內(nèi)含子分析轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)(+1)

cDNAhairpin西南大學(xué)西南大學(xué)(8)DNA松弛酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶)DNA松弛酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶)在DNA上產(chǎn)生一個(gè)缺刻，使DNA解螺旋后再封閉。與DNAligase不同的是不需要ATP參與。用途:PCR產(chǎn)物的TA克隆，起連接酶的作用。如寶生物的pMT18-T載體連接試劑盒，

Invitrogen公司的pCRII-TOPO載體連接試劑盒.西南大學(xué)西南大學(xué)§2基因克隆載體基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類(lèi)。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，注意不能破壞載體的自我復(fù)制性質(zhì)。如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。西南大學(xué)西南大學(xué)基因克隆載體

載體結(jié)構(gòu)插入(kb）代表載體PlasmidPhagemidBacteriophageFosmidCosmidP1cloneMiniF-basedPlasmidPACBACYACMACBiBAC質(zhì)粒

噬菌體

粘粒

P1衍生的人工染色體細(xì)菌人工染色體酵母人工染色體哺乳動(dòng)物人工染色體雙元細(xì)菌人工染色體環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線(xiàn)狀DNA環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線(xiàn)狀DNA環(huán)狀環(huán)狀質(zhì)粒7-107-1017-2035-4535-4770-10090-105100-300＜350100-2000？-10000300pBR322,pUC18，pBluescriptλgt10，λgt11，

pBAC108LpYAC2

pYLTAC17(23kb)西南大學(xué)西南大學(xué)

酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）、

細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）、

噬菌體P1克隆系統(tǒng)（P1clone）、由P1衍生的PAC載體(P1-derivedartificialchromosome,PAC

以大腸桿菌小F因子為基礎(chǔ)的載體（miniF-basedplasmid）

具有F因子和粘粒特征的Fosmid。

哺乳動(dòng)物基因克隆用的哺乳動(dòng)物人工染色體（mammalianartificialchromosome,簡(jiǎn)稱(chēng)MAC）

新型克隆載體—可轉(zhuǎn)化人工染色體(Transformation-competentArtificialChromosome)西南大學(xué)西南大學(xué)質(zhì)粒（plasmid）噬菌體(

phage）BAC載體(BACvector)

常用的載體（phagemid）西南大學(xué)西南大學(xué)是存在于天然細(xì)菌細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，通常帶有細(xì)菌的抗藥基因。1．質(zhì)粒Ori,復(fù)制起點(diǎn)，colE1MCS西南大學(xué)西南大學(xué)

最早的克隆載體是Cohen等（1973）構(gòu)建的質(zhì)粒（plasmid）pSC101。第一個(gè)比較理想的克隆載體pBR322。該質(zhì)粒分子大小為4.3kb，帶有抗四環(huán)素和抗氨芐青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等單一的限制酶切點(diǎn)。隨后克隆載體的整體結(jié)構(gòu)和克隆效率已有很大改善。

西南大學(xué)西南大學(xué)

pBR3224363bps1000200030004000ClaIHindIIIEcoRVNheIBamHISgrAISphIEcoNISalIPshAIXmaIIINruIBspMIBsmIStyIAvaIBalIBsgIPvuIIINdeISapIIIAflNIAlwIBsaIAseIPstIPvuIScaISspIIAatRIEcoTetoriAp西南大學(xué)西南大學(xué)

pUC182686bps5001000150020002500ApoIEcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaIHincIISalIPstISphIHindIIIEheINarINdeIAatIISspIXmnIScaIIGsuIBsaIIIAflISaplacApColE1pUC系列Uni.OfCaliforniapUC1……pUC18pUC19……pUC57西南大學(xué)西南大學(xué)質(zhì)粒pUC19的分子結(jié)構(gòu)西南大學(xué)西南大學(xué)

pGEM-3Zf+3197bps50010001500200025003000EcoRISacIKpnISmaIBamHIXbaISalIPstISphIHindIIISapIAflIIIAlwNIEam1105BsaIIGsuIScaIIIDraAIBsaINaeMINgolacZAmpf1pGEM系列pGEM-3Zf±……pGEM-7Zf±……pGEM-11Zf±pGEM-13Zf(±)西南大學(xué)西南大學(xué)pBlueScriptIIKS+pBlueScript系列pBlueScriptIKS+pBlueScriptIKS-pBlueScriptISK+pBlueScriptISK-pBlueScriptIIKS+pBlueScriptIIKS-pBlueScriptIISK+pBlueScriptIISK-西南大學(xué)西南大學(xué)pYES25857bps10002000300040005000HindIIIKpnISacIBamHIEcoRINotIXhoISphIXbaIBglIIApaINheIClaBISnaP-GAL1CYC1TTpUCoriApURA32uorif1ori酵母克隆和表達(dá)載體西南大學(xué)西南大學(xué)西南大學(xué)西南大學(xué)T-載體.pGEM-TEasyvectorpUCm-TpCRⅡ-TOPOpMD18-T西南大學(xué)西南大學(xué).

PstI27741Bg1IICTGCAGACCAGGTCTAGACTGGAGATCTGACGTCTGGTCCAGTTCTGACCTCTAGA西南大學(xué)西南大學(xué)T-載體.西南大學(xué)西南大學(xué)Features由pUC18改進(jìn)。

EcoRV處構(gòu)成gatT

ATCG

CTATtagC

.-T西南大學(xué)西南大學(xué)B-載體pUCm-B載體(自殺式平端克隆載體)

西南大學(xué)西南大學(xué)

2.噬菌體

phage（WT）:20min,100個(gè)改造的

phage:gt10,gt11ZAPTriplEx2(Lox/Cre)

DNA,50kb,20kb可切除12ntCos序列西南大學(xué)西南大學(xué)可通過(guò)轉(zhuǎn)染方式將其DNA送入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行增殖。常用的為人工構(gòu)建的λ噬菌體載體。噬菌體兩端的片段對(duì)于其包裝是必需的，因而應(yīng)予保留；而其中間部分則可進(jìn)行改造或置換，使之具有某種單一的限制酶切點(diǎn)。目的基因與噬菌體DNA進(jìn)行重組時(shí)，可采用插入重組方式，也可采用置換重組方式。

西南大學(xué)西南大學(xué)

M13phage20min,100個(gè)Copy:100-200絲狀phage,

6500nt的單鏈閉環(huán)DNA,

只吸附到E.coli的F傘毛上，只侵染F或Hfr大腸桿菌，只有507nt

為基因間隔區(qū)，為非必需區(qū)，可裝載300-400bp,>1000bp

不穩(wěn)定不對(duì)稱(chēng)復(fù)制包被M13f1WTM13phagessDNA開(kāi)鏈進(jìn)入E.colidsDNA大量復(fù)制dsDNA合成外殼蛋白西南大學(xué)西南大學(xué)哺乳動(dòng)物常用猴SV40病毒載體，通過(guò)感染方式將其DNA送入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行增殖。植物已開(kāi)發(fā)出煙草脆裂病毒(TRV)和大麥條紋花葉病毒(BSMV)的表達(dá)載體，

（如用于VIGS(Virus-inducedgenesilencing)）3．病毒：西南大學(xué)西南大學(xué)基因克隆載體

載體結(jié)構(gòu)插入(kb）代表載體PlasmidPhagemidBacteriophageFosmidCosmidP1cloneMiniF-basedPlasmidPACBACYACMACBiBAC質(zhì)粒

噬菌體

粘粒

P1衍生的人工染色體細(xì)菌人工染色體酵母人工染色體哺乳動(dòng)物人工染色體雙元細(xì)菌人工染色體環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線(xiàn)狀DNA環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒線(xiàn)狀DNA環(huán)狀環(huán)狀質(zhì)粒7-107-1017-2035-4535-4770-10090-105100-300＜350100-2000？-10000300pBR322,pUC18，pBluescriptλgt10，λgt11，

pBAC108LpYAC2

pYLTAC17(23kb)西南大學(xué)西南大學(xué)§3常用的宿主細(xì)菌K12TOPO1、……、TOPO10JM101、……、JM109DH5、……、DH10XL1-Blue（染色體帶Tn10，具Tet抗性）Escherichia

coliHoststrainsBM25.8西南大學(xué)西南大學(xué)GenotypeofXL1-Blue

endA1,gyrA96,hsdR17,lac–,recA1,relA1,

supE44,thi-1,[F'lacIqZDM15,proAB,Tn10]Note:Tn10confersresistancetotetracycline.Reference:Woodetal.,1985Stock/plate:LB/tet(15mg/ml)Application:-Libraryplating&screening-Blue/white(b-galactosidase)screening-Regulatedexpressionofclonedgenes西南大學(xué)西南大學(xué)GenotypeofBM25.8

supE44,thiD(lac–proAB)[F’traD36,proAB+,lacIqZDM15],imm434(kanR)P1(camR)hsdR(rk12–mk12–)Note:BM25.8islysogenicforphageslandP1andisusedforautomaticsubcloning.Reference:Palazzoloetal.,1990Stock/plate:LB/kan(50mg/ml)/cam(34mg/ml)Application:Cre-lox-mediatedexcisionofpTriplEx2fromlTriplEx2西南大學(xué)西南大學(xué)E.colistrain的保存方法保存方法有效時(shí)間1LB平板，4℃貯存1-3個(gè)月2LB固體培養(yǎng)基，穿刺密封，4℃貯存2年345%甘油，密封，4℃貯存長(zhǎng)期保存？415%～20%甘油，-40℃～-86℃低溫冰箱貯存長(zhǎng)期保存5真空干燥牛奶管，4℃貯存長(zhǎng)期保存（>10年？）Note:保存時(shí)間受很多因素影響，因此要定期檢查，多份保存。西南大學(xué)西南大學(xué)§4原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定一、DNA重組技術(shù)選用適當(dāng)?shù)腞E，分別對(duì)載體DNA和目的基因進(jìn)行剪切，以便于重組。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesiveend)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。

1.載體和目的基因的剪切西南大學(xué)西南大學(xué)2.載體和目的基因的連接粘端連接平端連接加接頭后連接

同聚尾連接即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來(lái)，得到重新組合后的DNA分子。

Taq

DNA聚合酶加“A”尾后與T載體進(jìn)行TA克隆西南大學(xué)西南大學(xué)（1）粘性末端連接法：當(dāng)載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過(guò)粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。西南大學(xué)西南大學(xué)載體DNA與目的基因的連接西南大學(xué)西南大學(xué)（2）平端連接法：用T4連接酶加PEG(聚乙二醇)提高連接效率，但要防止外源DNA片段串聯(lián)插入插入的方向隨機(jī)效率通常不高西南大學(xué)西南大學(xué)（3）人工接尾法：即同聚物加尾連接法(同聚尾連接)。當(dāng)載體和目的基因無(wú)法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無(wú)法得到相同得粘性末端時(shí)，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過(guò)堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由DNA連接酶連接。

RERE末端轉(zhuǎn)移酶dCTPdGTPCCCCGGGGGG西南大學(xué)西南大學(xué)將人工接頭（即一段含有多種限制酶切點(diǎn)的DNA片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。

（4）人工接頭連接法：A.銜接體（Linker）B.接合體（Adaptor）西南大學(xué)西南大學(xué)A.銜接體（Linker）：人工合成的雙鏈DNA短片段，8-12bp,平端分子，包含一個(gè)粘性末端的RE位點(diǎn)。BamHIlinker(10mer):CGGGATCCCGGCCCTAGGGCCGGGCCCTAGGGATCCCGGGCEcoRIlinker(12mer):CCGGAATTCCGGGGCCTTAAGGCC西南大學(xué)西南大學(xué)銜接體（Linker)的應(yīng)用平端分子dam甲基化酶-GATC--GATC-CH3甲基化酶CH3CH3CH3CH3T4DNALigaseRE酶切CH3CH3粘端分子西南大學(xué)西南大學(xué)HOPOHOHB.接合體（Adaptor）：人工合成的雙鏈DNA短片段，非平端分子，一端為平端，另一端為粘端。粘端是RE切開(kāi)的殘基粘端的5’端去磷酸化，以防接頭自連接。EcoRIAdaptor:AATTCCGTTGCTGTCGGGCAACGACAGCHOOHPO32-HO5’5’3’3’PHOOHOH西南大學(xué)西南大學(xué)接合體（Adaptor)的應(yīng)用T4DNALigase平端分子PPOHHO多核苷酸激酶kinaseATPPHOOHHOPHOOHHOHOPOHOH粘端分子OHOHHOHOPOHHOPOHOHHOHO西南大學(xué)西南大學(xué)3.轉(zhuǎn)化重組DNA需導(dǎo)入宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖或表達(dá)。重組質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化（transformation）方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞。把純化的DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程叫做轉(zhuǎn)化，即將大腸桿菌用CaCl2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，再與重組質(zhì)粒DNA短暫溫育，質(zhì)粒DNA即可導(dǎo)入宿主細(xì)胞。

可以接受DNA的細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞（competentcalls）。西南大學(xué)西南大學(xué)常用缺少RE酶基因的細(xì)菌，即重組缺陷型（RecA-）菌株，避免外源DNA不被降解和發(fā)生同源重組。電穿孔法（Electroporation）熱激法一步法（2xTSS）西南大學(xué)西南大學(xué)如果是用λ噬菌體作為載體的重組體，則需要用外殼蛋白進(jìn)行包裝，使之成為具有感染能力的噬菌體，再通過(guò)轉(zhuǎn)染(t