第3章

基因工程工程第2節(jié)

基因工程的基本操作程序（第二課時）目標(biāo)010203針對人類生產(chǎn)和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構(gòu)想，完成初步設(shè)計(jì)。（科學(xué)探究）結(jié)合實(shí)例，采用文字和圖示方式說明基因工程的基本操作程序。（科學(xué)思維）學(xué)習(xí)目標(biāo)運(yùn)用結(jié)構(gòu)與功能觀等觀念理解PCR技術(shù)的過程、原理、條件等（生命觀念）耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（DNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’

變性

復(fù)性

延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。溫故知新：PCR擴(kuò)增目的基因的過程溫故知新：PCR之歌問題1:獲取了足夠量的目的基因后，可以直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？問題1:獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解

不能原因那怎樣才能讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的？載體還需要哪些結(jié)構(gòu)？各個元件有什么作用？請文字和箭頭表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程。234

1合作探究一：請同學(xué)們自主閱讀教材P80，小組合作思考討論完成問題。

一、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)是隨意的嗎？使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會得到一種重組DNA？如果不能，怎么改進(jìn)？一、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（一）目的：①讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代;

（二）組成：質(zhì)粒①啟動子基因的前端，RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位；驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA②終止子：限制酶切割位點(diǎn)基因的尾端，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄③標(biāo)記基因作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來④復(fù)制原點(diǎn)⑤目的基因②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用問題2:目的基因該插入什么位置？基因工程的核心一、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（二）組成：基因工程的核心問題2:目的基因該插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。啟動子和終止子之間的部位誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)誘導(dǎo)型啟動子：問題3:辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”。啟動子與終止子位于DNA分子中，作用：起始和終止轉(zhuǎn)錄過程。啟動密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，作用：起始和終止翻譯過程。一、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心問題3:辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”。（二）組成：問題4:請文字和箭頭表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程。同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割DNA連接酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因限制酶切割位點(diǎn)質(zhì)粒重組DNA分子限制酶限制酶一、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心（三）過程：問題5:使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會得到一種重組DNA？有何缺點(diǎn)？怎么改進(jìn)？一、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（三）過程：問題5:使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會得到一種重組DNA？有何缺點(diǎn)？怎么改進(jìn)？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1單酶切缺點(diǎn)：①質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化；②質(zhì)粒與目的基因反向連接問題6:如何解決這一問題？雙酶切實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

1.某目基因兩側(cè)的DNA序列所含的限制酶酶切位點(diǎn)如圖所示,下列可作該目的基因最佳載體的是 (

)

A

BC

D2.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前,需構(gòu)建基因表達(dá)載體,圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基因所在DNA片段,圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時需要使用的工具酶為

。

(2)用圖中的質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體時,不能使用SmaⅠ切割,原因是

。

(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時,可用EcoRⅠ同時切割質(zhì)粒和DNA,但會導(dǎo)致

等問題,為避免以上問題出現(xiàn),應(yīng)使用

兩種限制酶。

SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因自身環(huán)化、目的基因不能定向連接BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)限制酶和DNA連接酶(4)構(gòu)建好的基因表達(dá)載體在目的基因前要加上

,其是

識別和結(jié)合的部位。

RNA聚合酶啟動子實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

3.下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是()A.啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼B.啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C.標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D.基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

4.下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述，錯誤的是（

）A.啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)，組成它的基本單位是脫氧核苷酸B.基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動子、終止密碼子、標(biāo)記基因

等組件C.人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可激活或抑制目的基因

的表達(dá)D.由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

5.圖甲、圖乙分別表示質(zhì)粒和外源DNA，其中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，下列敘述正確的是(

)A.用質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中，不能使用SmaⅠ切割B.圖甲所示的質(zhì)粒分子在經(jīng)SmaⅠ酶切割后含有4個游離的磷酸基團(tuán)C.為獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶D.用EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ中的任意一種酶切割質(zhì)粒和外源基因都可以將目的基因與載體結(jié)合，構(gòu)建好基因表達(dá)載體后，下面該進(jìn)行什么操作？基因工程第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞一、基因表達(dá)載體的構(gòu)建總結(jié)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些？各自適用于什么生物？23

1合作探究二：請同學(xué)們自主閱讀教材P81，小組合作思考討論完成問題。

農(nóng)桿菌的特點(diǎn)？農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理。二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞請文字和箭頭表示農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程。二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動物細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)化法病毒介導(dǎo)法顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法（一）方法：（1）花粉管通道法（我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）方法2：在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）方法：1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）方法：1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。實(shí)質(zhì)是基因重組。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到被侵染的受體細(xì)胞，并將其整合到該細(xì)胞染色體的DNA上。②原理：目的基因Ti質(zhì)粒表達(dá)載體農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體DNA新性狀植株構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入插入表達(dá)二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）方法：1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法③過程：二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）方法：2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（1）顯微注射法構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射法將基因表達(dá)載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植（移植到同期發(fā)情的母畜子宮內(nèi)）獲得具有新性狀的動物①體積大，易操作；②全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）方法：2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（2）病毒介導(dǎo)法拓展延伸科學(xué)家也用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進(jìn)入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對S蛋白的免疫記憶。

Ca2+處理目的可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。受體細(xì)胞（1）原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）（2）優(yōu)點(diǎn)：繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)。二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）方法：3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）Ca2+處理法Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收實(shí)例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）方法：3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）Ca2+處理法實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

6.我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞，是一種十分簡便經(jīng)濟(jì)的方法，對此認(rèn)識正確的是A.不必構(gòu)建表達(dá)載體就可以直接導(dǎo)入B.此方法可用于轉(zhuǎn)基因動物C.受體細(xì)胞只能是植物的卵細(xì)胞D.有時可以取代農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

A.圖中Ⅰ是質(zhì)粒，步驟①需要用到限制酶和DNA連接酶B.圖中Ⅱ是含目的基因的重組質(zhì)粒，步驟②是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入棉花細(xì)胞C.圖中Ⅲ是農(nóng)桿菌，通過步驟③將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞D.剔除培育成功的抗蟲棉體內(nèi)的四環(huán)素抗性基因不會影響抗蟲基因的表達(dá)7.如圖為科學(xué)家通過基因工程培育抗蟲棉時，從蘇云金桿菌中提取抗蟲基因“放入”棉花細(xì)胞中，與棉花的DNA分子“結(jié)合起來”而發(fā)揮作用的過程示意圖。以下相關(guān)說法不正確的是實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

8.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的方法正確的是（）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中；②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入農(nóng)桿菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)④將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，借助花粉管通道進(jìn)入受精卵。A.①②B.③④C.②③D.①④實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

9.科研人員以抗四環(huán)素基因?yàn)闃?biāo)記基因,通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產(chǎn)鼠的β-珠蛋白,治療鼠的鐮狀細(xì)胞貧血。下列相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,不合理的是(

)A.構(gòu)建的表達(dá)載體除了目的基因外,還需要啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因B.用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基可以篩選出已經(jīng)導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌C.小鼠的β-珠蛋白基因可以直接轉(zhuǎn)給大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)得到β-珠蛋白D.用Ca2+處理大腸桿菌后,表達(dá)載體易于導(dǎo)入大腸桿菌中問題7:將表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達(dá)？結(jié)合基因表達(dá)的過程，推測可以從哪些方面進(jìn)行檢測與鑒定？

檢測目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等三、目的基因的檢測與鑒定（一）目的：（二）檢測內(nèi)容及方法：三、目的基因的檢測與鑒定（二）檢測內(nèi)容及方法：（1）基因是否插入染色體DNAPCR技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物提取DNADNA作為模板PCR操作是否擴(kuò)增出目的基因電泳操作M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果1.分子水平的檢測三、目的基因的檢測與鑒定（二）檢測內(nèi)容及方法：PCR技術(shù)（2）目的基因是否轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)基因生物PCR操作是否擴(kuò)增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA提取RNAmRNA作為模板1.分子水平的檢測三、目的基因的檢測與鑒定（二）檢測內(nèi)容及方法：（3）目的基因是否翻譯抗原-抗體雜交技術(shù)提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交脫分化蘇云金桿菌1.分子水平的檢測基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第一步第二步第三步第四步目的基因的檢測與鑒定課堂小結(jié)前提核心關(guān)鍵保證利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物);分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等。實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

10.下列哪一種方法不能用于檢測目的基因是否成功導(dǎo)入或表達(dá)A.在顯微鏡下直接觀察受體細(xì)胞中是否含有目的基因B.通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞的DNA分子上是否含有目的基因C.提取受體細(xì)胞合成的相應(yīng)蛋白質(zhì)，利用抗原—抗體特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測D.抗蟲基因?qū)胫参锛?xì)胞后，檢測植物是否具有抗蟲特性實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

11.科學(xué)家將人的生長激素基因與某種細(xì)菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子進(jìn)行重組，并成功地在該細(xì)菌中得以表達(dá)(如圖)。下列相關(guān)敘述錯誤的是（

）A.過程①合成人生長激素基因的過程

需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶B.過程③是將重組質(zhì)粒溶于緩沖液后

與經(jīng)Ca2＋處理的細(xì)菌B混合C.成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的細(xì)菌B在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能生長D.可采用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測工程菌中生長激素基因是否成功表達(dá)實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

12.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，需要檢測目的基因是否可以維持穩(wěn)定和表達(dá)其遺傳特性。下列關(guān)于目的基因的檢測和鑒定的敘述，正確的是(

)A．目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是能否轉(zhuǎn)錄出mRNAB．可采用PCR檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄和翻譯C．可從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)來檢測目的基因是否翻譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)D．抗蟲、抗病檢驗(yàn)用于確定轉(zhuǎn)基因生物是否具備相關(guān)性狀屬于分子水平的檢測實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練

13．菊