高效液相色譜與氣相色譜技術(shù)在中藥檢驗(yàn)中的應(yīng)用安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院劉軍玲現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四主要內(nèi)容高效液相色譜法氣相色譜法現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法一.高效液相色譜法概述二.高效液相色譜法中的一些相關(guān)術(shù)語(yǔ)三.范第姆特方程及其在高效液相色譜中的應(yīng)用四.高效液相色譜儀的簡(jiǎn)介五.高效液相色譜儀的使用與保養(yǎng)六.高效液相色譜儀常見(jiàn)故障分析七、舉例八.高效液相色譜儀的檢定現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—特點(diǎn)一、高效液相色譜法的概述1、.高效液相色譜法的特點(diǎn)2、高效液相色譜法的分類3、高效液相色譜法的影響因素4、高效液相色譜法的應(yīng)用5、超高效液相色譜（UPLC）現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—特點(diǎn)1.高效液相色譜法的特點(diǎn)1.1原理：利用混合物中各組分在不同的兩相中溶解，分配，吸附等作用性能的差異，當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離。相：在某一系統(tǒng)中，具有相同成分及相同物理和化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)部分。各相之間有明顯可分的界面?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—特點(diǎn)

1.2高效液相色譜法高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是在六十年代末，以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜法的理論與試驗(yàn)方法，流動(dòng)相改為高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)?，F(xiàn)在是6頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—特點(diǎn)

適用范圍廣分離效率高（理論板數(shù)達(dá)兩萬(wàn)，分離上百個(gè)成分）速度快流動(dòng)相可選擇范圍寬靈敏度高（高靈敏度的檢測(cè)器）色譜柱可反復(fù)使用流出組分容易收集（樣品回收容易，且定量）安全現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—分類

2.高效液相色譜法的分類以固定相的聚集狀態(tài)分：液－液色譜

液－固色譜以分離機(jī)制分：分配色譜吸附色譜離子交換色譜分子排阻色譜現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—分類

類型固定相流動(dòng)相出峰順序正相色譜極性填料（氰基與氨基化學(xué)鍵合相）非極性或弱極性溶劑極性小的先流出反相色譜非極性填料（十八烷基硅烷鍵合相）極性或中等極性溶劑極性大的先流出現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—分類將離子對(duì)試劑加入極性流動(dòng)相中，被分析的離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑生成不帶電的中性離子對(duì)，從而增加了在非極性固定相中的溶解度，從而改善分離效果。

解度，從而改善分離效果。

反向離子對(duì)色譜現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—分類解度，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制組分解離，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的?？捎糜诜治?≤

pKa≤7弱酸和7≤

pKa≤8弱堿

注意：pH值應(yīng)控制在2～

8。

從而改善分離效果。

離子抑制色譜現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—影響因素

載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量、鍵合類型等以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充柱的粒徑一般在3~10μm之間，粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)經(jīng)約2mm)填充劑的性能現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—影響因素

以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過(guò)40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過(guò)60℃柱溫現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—影響因素

pH值應(yīng)控制在2～8。

當(dāng)pH值大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH值小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。

當(dāng)色譜系統(tǒng)中使用pH值大于8時(shí)的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑

當(dāng)色譜系統(tǒng)中使用pH值小于2時(shí)的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑流動(dòng)相現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—影響因素

反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇—水系統(tǒng)（采用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，首選乙腈—水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動(dòng)相。由于Ｃ18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于５％，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。流動(dòng)相的選擇現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—影響因素各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。其中調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，以組分比例較低者（小于或等于50％）相對(duì)于自身的改變量不超過(guò)±30％且相對(duì)于總量的改變量不超過(guò)±10％為限，如30％相對(duì)改變量的數(shù)值超過(guò)總量的10％時(shí)，則改變量以總量的±10％為限。對(duì)于必須使用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項(xiàng)下注明現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—應(yīng)用定性分析定量分析現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—應(yīng)用定性分析色譜鑒定法：利用保留時(shí)間相互對(duì)照，進(jìn)行定性分析化學(xué)鑒定法：收集各組分流出液，用官能團(tuán)鑒定試劑進(jìn)行定性分析兩譜連用：液質(zhì)聯(lián)用現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜法—應(yīng)用定量分析外標(biāo)法－標(biāo)準(zhǔn)曲線法－外標(biāo)一點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)法－標(biāo)準(zhǔn)曲線法－內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法－校正因子法面積歸一化法現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四UPLC超高效液相色譜超高速度超高靈敏度超高分離度

利用高效創(chuàng)新小顆粒填料（1.7μL），獲得超強(qiáng)分離能力，更高的柱效和更窄的色譜峰，意味著更高的色譜峰高和更高的靈敏度在得到超高分離度和超高速度的同時(shí)能夠得到超高靈敏度

現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—相關(guān)術(shù)語(yǔ)二、高效液相色譜中的一些相關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜峰與基線色譜儀以電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間做圖所繪制的曲線，即色譜圖。曲線突出的部分即色譜峰，水平部分即基線。

峰高（h）色譜峰最高點(diǎn)到峰底的垂直距離。

峰寬（W）峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作的兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。半高峰寬（W1/2）峰高度一半處的峰寬。峰面積（A）峰曲線與峰底（基線）所包圍的面積?，F(xiàn)在是21頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—相關(guān)術(shù)語(yǔ)死時(shí)間（t0）不保留組分從進(jìn)樣開(kāi)始到流出色譜柱所需的時(shí)間，即流動(dòng)相通過(guò)色譜柱的間。死體積（V0）柱中溶劑的總體積，即流動(dòng)相的體積。保留時(shí)間（tR）樣品通過(guò)色譜柱所需的時(shí)間，即從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)的組分濃度最大值，所需的時(shí)間。保留體積（VR）從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)的組分濃度最大值時(shí)流出溶劑的總體積。調(diào)整保留時(shí)間（tRˊ）扣除了死時(shí)間的保留時(shí)間。調(diào)整保留體積（VRˊ）扣除了死體積的保留體積?，F(xiàn)在是22頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)參數(shù)。其中，分離度和重復(fù)性尤為重要。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，必要時(shí)，可對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以符合要求。色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)理論塔板數(shù)（N）理論塔板數(shù)N表示：組分流過(guò)色譜柱時(shí)，在兩相間進(jìn)行平衡分配的總次數(shù)。用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)，一般為待測(cè)組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。N是色譜柱的分離效率的定量表達(dá)方式，當(dāng)色譜峰為對(duì)稱并符合高斯分布，理論板數(shù)可近似的表達(dá)為:

5.54（ｔＲ／Wh/2）2現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)分離度（R）用于評(píng)價(jià)待測(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)。可以通過(guò)測(cè)定待測(cè)物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過(guò)測(cè)定待測(cè)組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到?，通過(guò)測(cè)定待測(cè)組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)與控制。無(wú)論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測(cè)峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照峰之間有較好的分離度。現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)分離度（R）分離度（R）指相鄰兩峰的分離程度。簡(jiǎn)單的說(shuō)分離度就是兩峰相對(duì)于其峰寬分開(kāi)得有多遠(yuǎn)。定量分析時(shí)分離度應(yīng)不小于1.5。R＝現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)重復(fù)性對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)拖尾因子（T）用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。為保證分離效果和測(cè)量精度，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。峰高法定量時(shí)，拖尾因子T

應(yīng)0.95～1.05之間。峰面積法測(cè)定時(shí)，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測(cè)量。必要時(shí)，應(yīng)在各品種項(xiàng)下對(duì)拖尾因子作出規(guī)定?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)測(cè)定法內(nèi)標(biāo)法：各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取—定量注人儀器，記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子：校正因子（f)＝AS/CS×CR/AR再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：含量=f×AX/A’S/C’S采用內(nèi)標(biāo)法,可避免因樣品前處理及進(jìn)樣體積誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——相關(guān)術(shù)語(yǔ)測(cè)定法外標(biāo)法：含量=CR×AX/AR各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注人儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——范第姆特方程

當(dāng)色譜柱長(zhǎng)L固定時(shí)，理論塔板高度值H越小，理論塔板數(shù)N越高，柱效率越高，分離能力越強(qiáng)。三、范第姆特（VanDeemter）方程

1956年荷蘭學(xué)者范第姆特（VanDeemter）等人在研究氣相色譜時(shí)，提出了色譜過(guò)程動(dòng)力學(xué)理論，他們吸收塔板高度的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合進(jìn)去，指出理論塔板高度H是峰寬的量度，導(dǎo)出了塔板高度H與線速度的關(guān)系式：

現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——范第姆特方程

H：理論塔板高度，是指為使組分在柱內(nèi)兩相間達(dá)到一次分配平衡所需要的柱長(zhǎng)。

A：渦流擴(kuò)散項(xiàng)（與固定相顆粒大小、幾何形狀及裝填緊密程度有關(guān)）

B/u：分子擴(kuò)散項(xiàng)（很小，一般可以忽略不計(jì)）

Cu：傳質(zhì)阻力項(xiàng)，它與流動(dòng)相的粘度和柱溫有關(guān)

現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——范第姆特方程

理論塔板高度H與理論塔板數(shù)N的關(guān)系：N=L/H當(dāng)色譜柱長(zhǎng)L固定時(shí)，理論塔板高度值H越小，理論塔板數(shù)N越高，柱效率越高，分離能力越強(qiáng)。

當(dāng)色譜柱長(zhǎng)L固定時(shí)，理論塔板高度值H越小，理論塔板數(shù)N越高，柱效率越高，分離能力越強(qiáng)?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜——范第姆特方程

1、減小填料顆粒粒度2、用粘度低的溶劑作流動(dòng)相3、采用低流速流動(dòng)相4、適當(dāng)提高柱溫

當(dāng)色譜柱長(zhǎng)L固定時(shí)，理論塔板高度值H越小，理論塔板數(shù)N越高，柱效率越高，分離能力越強(qiáng)。由范第姆特方程，我們可以推出，為了提高柱效，我們可以采用以下方法:現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介

高效液相色譜儀的簡(jiǎn)介一臺(tái)高效液相色譜儀一般由輸液泵，進(jìn)樣器，色譜柱，檢測(cè)器，記錄儀等幾個(gè)部分組成?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介

輸液泵是用來(lái)輸送流動(dòng)相的。色譜儀對(duì)泵的要求：無(wú)脈動(dòng)，流量恒定耐高壓，耐腐蝕

1、輸液泵

現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介

2、進(jìn)樣器

隔膜進(jìn)樣器——只能在低壓或停流狀態(tài)下進(jìn)樣，易漏液六通進(jìn)樣閥——進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好自動(dòng)進(jìn)樣器——進(jìn)樣量準(zhǔn)確，可按要求改變進(jìn)樣量現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介常用的反相色譜柱是以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八，碳八，胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，為固定相。優(yōu)點(diǎn)：－固定相穩(wěn)定，不易流失，機(jī)械性能好－應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑缺點(diǎn)：－pH值不能小于2（鍵合相水解），也不能大于8（硅膠溶解）－同樣填料，各種品牌色譜柱不盡相同

3、色譜柱

現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介檢測(cè)器是色譜儀的“眼睛”專用型紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器通用型示差折光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器4、檢測(cè)器現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器，二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器（只能檢測(cè)能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)）。（在分析氨基酸時(shí)，采用柱前衍生法制備衍生物，使用熒光檢測(cè)器檢測(cè)）

電化學(xué)檢測(cè)器（利用組分的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流或電壓的變化進(jìn)行檢測(cè)，（靈敏度很高，但對(duì)于不能氧化還原的物質(zhì)，不適用）質(zhì)譜檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查?，F(xiàn)在是40頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介選擇性檢測(cè)器：紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；通用型的檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器，是利用組分與流動(dòng)相的折射率之差進(jìn)行檢測(cè)的（只對(duì)少數(shù)類別的物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度高）對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)。現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—簡(jiǎn)介

紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計(jì)算時(shí)，—般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動(dòng)相。現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

五.高效液相色譜儀的使用與保養(yǎng)1.使用前的準(zhǔn)備：流動(dòng)相的準(zhǔn)備樣品溶液的準(zhǔn)備2.使用與保養(yǎng)：輸液泵的使用與保養(yǎng)檢測(cè)器的使用與保養(yǎng)色譜柱的使用與保養(yǎng)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

色譜柱對(duì)流動(dòng)相的要求：

－過(guò)濾除去雜質(zhì)－純度的要求－緩沖液pH值在填料允許的范圍（一般2－8）內(nèi)－緩沖鹽濃度不要太高－流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度1.1流動(dòng)相的準(zhǔn)備現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.2流動(dòng)相脫氣的目的

1.2流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確－提高色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性提高檢測(cè)器的性能－消除因流動(dòng)相中含有氣泡而產(chǎn)生的尖峰－基線穩(wěn)定，信噪比增加

保護(hù)色譜柱－防止色譜柱中填料被氧化

現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

加熱——操作較復(fù)雜，易使流動(dòng)相的組成變化抽真空——溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲——簡(jiǎn)單，效果較差，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)通惰性氣體——一般用氦氣，效果好，成本高在線脫氣機(jī)——在線連續(xù)脫氣平時(shí)試驗(yàn)中流動(dòng)相一般是先抽濾，再超聲脫氣，然后使用，既方便，也基本能滿足檢驗(yàn)要求。1.2流動(dòng)相脫氣的目的流動(dòng)相脫氣的方法現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存1.4流動(dòng)相的保存有機(jī)流動(dòng)相的保存溶劑流動(dòng)相

－室溫下密封，避光保存含緩沖鹽流動(dòng)相

－現(xiàn)配現(xiàn)用－低溫下密封保存，一般不超過(guò)3天－防止有機(jī)相揮發(fā)，防止微生物生長(zhǎng)選用適宜的容器

－塑料容器對(duì)超聲波有吸收作用－一般保存在棕色玻璃瓶中現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存1.5流動(dòng)相的平衡一般平衡0.5－－1小時(shí)就可以穩(wěn)定工作含離子對(duì)試劑的流動(dòng)相平衡的時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)一些?，F(xiàn)在是48頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存2樣品溶液的制備樣品預(yù)處理的目的：－除去微粒－減少干擾雜質(zhì)－提高檢測(cè)器的靈敏度和選擇性－改善分離的效果－有利于保護(hù)色譜柱及儀器現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存2.1樣品溶液常用的處理方法過(guò)濾，高速離心——10000rpm超濾——基于分子量的分離技術(shù)選擇性沉淀——生化樣品中除蛋白衍生反應(yīng)——提高檢測(cè)的靈敏度液－液萃取——富集微量組分固相提取現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存3輸液泵的維護(hù)保養(yǎng)流動(dòng)相要過(guò)濾常用緩沖鹽時(shí)，停泵前要用水清洗泵頭關(guān)閉排液閥時(shí)，不要太用力擰，以不滲液為準(zhǔn)更換流動(dòng)相時(shí)，要保證兩種溶劑的互溶性色譜泵停用時(shí)，應(yīng)先用水洗去緩沖鹽，然后用純甲醇充滿泵頭和管路，并保存在純甲醇中現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存4、檢測(cè)器的使用和保養(yǎng)如果長(zhǎng)時(shí)間不用檢測(cè)器可以關(guān)掉光源燈－僅在4小時(shí)以上不用時(shí)，才需關(guān)燈－頻繁開(kāi)關(guān)燈也會(huì)影響燈壽命不要讓緩沖鹽長(zhǎng)期停滯在檢測(cè)池內(nèi)－用純水沖洗－保存在純甲醇中現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存5、色譜柱的使用和保養(yǎng)1.拿到一根新的色譜柱的時(shí)要仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)（用甲醇活化，沖1－2個(gè)小時(shí)）2.使用保護(hù)柱（多數(shù)保護(hù)柱都會(huì)影響到整個(gè)色譜柱的柱效，保護(hù)柱應(yīng)選用與所用色譜柱品牌和內(nèi)徑一致的）3.注意色譜柱的連接：方向4.注意色譜柱的存放現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存6、色譜柱的連接一般柱子接頭為不銹鋼卡套接頭或PEEK（聚醚醚酮）工程塑料管線手?jǐn)Q接頭。使用不銹鋼卡套接頭時(shí)，當(dāng)完成第一次安裝后，不銹鋼卡套已固定死，當(dāng)接不同的柱子時(shí)，要注意柱子接頭處的形狀和長(zhǎng)度，否則會(huì)產(chǎn)生一個(gè)非常大的死體積。樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積，都會(huì)使樣品分子擴(kuò)散和滯留，都會(huì)引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。

現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存不同品牌色譜柱接頭長(zhǎng)度的比較現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存不同品牌色譜柱接頭長(zhǎng)度示意圖現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

1.4流動(dòng)相的保存死體積對(duì)色譜峰的影響現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

接頭接頭長(zhǎng)度不合適造成的滲漏現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

接頭建議使用整體式PEEK工程塑料接頭優(yōu)點(diǎn)

PEEK管路容易連接；接頭不僅無(wú)需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長(zhǎng)度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。缺點(diǎn)

PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好，遇到上述溶劑會(huì)變脆。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi的壓力。壓力太高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。

現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜儀—使用與保養(yǎng)

接頭7色譜柱的存放存放前的處理——除去雜質(zhì)和緩沖鹽合適的存放溶劑——一般存放在純甲醇中避免色譜柱床的干涸——兩頭要擰緊，隔3～4個(gè)月用甲醇適當(dāng)沖洗避免機(jī)械振動(dòng)——輕拿輕放防止細(xì)菌生長(zhǎng)注意存放的溫度（凝膠柱不能存放在冰箱里）現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

高效液相色譜常見(jiàn)故障的分析1.色譜峰問(wèn)題2.系統(tǒng)壓力問(wèn)題3.基線噪音問(wèn)題現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

原則一：確認(rèn)問(wèn)題至少發(fā)生兩次以上原則二：從最簡(jiǎn)單的因素入手原則三：一次只變化一個(gè)因素原則四：恢復(fù)原狀原則五：養(yǎng)成良好的記錄判斷故障的原則現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

1.色譜峰問(wèn)題－雙峰或肩峰－進(jìn)樣量或樣品濃度過(guò)大－保護(hù)柱或色譜柱進(jìn)口堵塞

－柱頭塌陷現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

2、色譜峰問(wèn)題－前伸峰

－進(jìn)樣量或樣品濃度過(guò)大－溶解樣品的溶劑相對(duì)于流動(dòng)相太強(qiáng)－保護(hù)柱或色譜柱污染或失效現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

色譜峰問(wèn)題－保留時(shí)間不穩(wěn)定

－系統(tǒng)不穩(wěn)定或未達(dá)化學(xué)平衡－泵壓力不穩(wěn)（泵頭里有氣泡）－進(jìn)樣體積過(guò)大或樣品濃度過(guò)大－溫度波動(dòng)－流動(dòng)相混合不均勻－系統(tǒng)滲漏現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

系統(tǒng)壓力問(wèn)題－壓力高

流動(dòng)相粘度大，流速高－管路或色譜柱堵塞（減小死體積，管路細(xì)）－壓力傳感器問(wèn)題現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

系統(tǒng)壓力問(wèn)題－壓力低或沒(méi)有壓力

－泵未正確排氣（泵頭有氣泡）－溶劑入口過(guò)濾頭堵－入口管路中有空氣－系統(tǒng)有滲漏現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—常見(jiàn)故障分析

流路基線噪音問(wèn)題

基線噪音大，基線漂移：－紫外燈光源能量不夠－流動(dòng)相脫氣不完全－系統(tǒng)中有滲漏－檢測(cè)器未正確接地－有遲流出的組分現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

枳殼

基線噪音大，基線漂移：1、取樣取本品粗粉0.2g，關(guān)注點(diǎn)粗粉的要求：指全部通過(guò)二號(hào)篩，但混有能通過(guò)四號(hào)篩不超過(guò)40%的粉末。2、稱量：供試品（平行樣品）、對(duì)照品(天平的要求）3、供試品溶液的制備4、過(guò)濾，取續(xù)濾液（濾膜）5、液相進(jìn)樣前的準(zhǔn)備：流動(dòng)相的配制、排氣、平衡流動(dòng)相6、重復(fù)性試驗(yàn)：色譜相應(yīng)值的重復(fù)性能，取柚皮苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%，說(shuō)明儀器性能良好，供試品每份樣品進(jìn)兩針，取平均值。七、舉例現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

枳殼

新橙皮苷現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

枳殼

新橙皮苷現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

計(jì)算

現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

計(jì)算

現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

計(jì)算

現(xiàn)在是74頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

銀杏葉片

萜類內(nèi)酯的測(cè)定：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

銀杏葉片

找原因：1、供試品前處理階段萃取的過(guò)程中，上下兩層一定要澄清，避免雜質(zhì)干擾。2、調(diào)蒸發(fā)溫度3、調(diào)流速4、微調(diào)流動(dòng)相5、色譜柱本身的干擾現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四六.舉例

銀杏葉片

找原因：1、供試品前處理階段萃取的過(guò)程中，上下兩層一定要澄清，避免雜質(zhì)干擾。2、調(diào)蒸發(fā)溫度3、調(diào)流速4、微調(diào)流動(dòng)相5、色譜柱本身的干擾本品流動(dòng)相為正丙醇-四氫呋喃-水（1：15：84），由此可看出水相比較大，因此蒸發(fā)溫度要在100~110℃之間才能保證完全霧化。因此調(diào)節(jié)蒸發(fā)溫度，得到下圖。現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

銀杏葉片

現(xiàn)在是78頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

復(fù)方丹參片：改變流動(dòng)相的組成比例

現(xiàn)在是79頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

復(fù)方丹參片：改變流動(dòng)相的組成比例

流動(dòng)相的組成比例為：現(xiàn)在是80頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

制川烏、制草烏：改變流動(dòng)相的組成比例

流動(dòng)相：梯度洗脫現(xiàn)在是81頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

制川烏、制草烏：改變流動(dòng)相的組成比例

流動(dòng)相：梯度洗脫在色譜峰分離達(dá)不到要求時(shí)也可調(diào)整比例現(xiàn)在是82頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

對(duì)于色譜柱的要求

現(xiàn)在是83頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

對(duì)于色譜柱的要求

現(xiàn)在是84頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

進(jìn)樣量的影響

15μl現(xiàn)在是85頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

進(jìn)樣量的影響

進(jìn)樣量做好在10μl左右5μl現(xiàn)在是86頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

色譜柱的影響

進(jìn)樣量做好在10μl左右5μl現(xiàn)在是87頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四高效液相色譜—舉例

色譜柱的影響

5μl色譜柱的活化現(xiàn)在是88頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四

高效液相色譜儀—檢定

泵：泵流量設(shè)定值誤差Ss≤±2%

泵流量穩(wěn)定性誤差SR≤±2%

定性重復(fù)性RSD≤1.5%

定量重復(fù)性RSD≤1.5%

紫外檢測(cè)器基線噪聲≤±5×10-4AU

基線漂移≤±5×10-3AU/h

最小檢測(cè)量≤4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）八、高效液相色譜儀的檢定現(xiàn)在是89頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜-組成現(xiàn)在是90頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜-組成現(xiàn)在是91頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜載氣現(xiàn)在是92頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式進(jìn)樣口部分GC進(jìn)樣方式現(xiàn)在是93頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式現(xiàn)在是94頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式現(xiàn)在是95頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式現(xiàn)在是96頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式現(xiàn)在是97頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式什么是不分流進(jìn)樣現(xiàn)在是98頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式什么是不分流進(jìn)樣現(xiàn)在是99頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式不分流進(jìn)樣的操作要點(diǎn)現(xiàn)在是100頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式GC進(jìn)樣方式現(xiàn)在是101頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式GC進(jìn)樣方式現(xiàn)在是102頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—進(jìn)樣方式GC進(jìn)樣方式現(xiàn)在是103頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜——固定相氣相色譜的固定相現(xiàn)在是104頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜氣相色譜——固定相毛細(xì)管柱管材現(xiàn)在是105頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜氣相色譜——固定相毛細(xì)管柱固定相現(xiàn)在是106頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜——固定相毛管柱固定相現(xiàn)在是107頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜——固定相固定相的選擇現(xiàn)在是108頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—色譜柱的選擇色譜柱的選擇現(xiàn)在是109頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜—色譜柱的選擇柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、膜厚選擇現(xiàn)在是110頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜現(xiàn)在是111頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜現(xiàn)在是112頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜毛細(xì)管柱流量的設(shè)定現(xiàn)在是113頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜-檢測(cè)器常用檢測(cè)器現(xiàn)在是114頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜-檢測(cè)器FID檢測(cè)器現(xiàn)在是115頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜-檢測(cè)器FID檢測(cè)器注意事項(xiàng)現(xiàn)在是116頁(yè)\一共有148頁(yè)\編輯于星期四氣相色譜-檢