突變mutation指生物體表型突然發(fā)生可遺傳變化第1頁/共63頁突變（mutation）：指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳變化。第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變突變?nèi)旧w畸變——細胞學上可以看到染色體的變化

基因突變——細胞學上看不到遺傳物質(zhì)的變化突變體（mutant）：發(fā)生了突變的微生物細胞或菌株野生型（wildtype）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株。第2頁/共63頁★依表型的改變分為：形態(tài)突變型——由突變引起的個體或菌落形態(tài)的變異。營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型。發(fā)酵突變型——喪失產(chǎn)生某種生物合成酶能力的突變型抗性突變型——因突變而產(chǎn)生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)量突變型——通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株。

（一）突變類型第3頁/共63頁★按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細胞來分：選擇性突變株（selectivemutant）：具有選擇標記（如營養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-selectivemutant）：無選擇標記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。第4頁/共63頁

定義：某一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株的數(shù)目來表示。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。在同一個細胞中同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的，因為雙重突變型的幾率只是各個突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用檢出選擇性突變株的手段，尤其是采用檢出營養(yǎng)缺陷型的恢復突變株（backmutant或reversemutant）或抗性突變株特別是抗藥性突變株的方法來加以確定。（二）突變率第5頁/共63頁（三）突變的特點

適用于整個生物界，以細菌的抗藥性為例。自發(fā)性：突變可在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。不對應性：突變性狀與突變原因之間無直接的對應關(guān)系。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響?？烧T變性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳?？赡嫘裕簭脑嫉囊吧突虻阶儺愔甑耐蛔兎Q為正向突 變（forwardmutation），從突變株回到野生型的 過程則稱為回復突變或回變（backmutation或 reversemutation）。第6頁/共63頁（四）基因突變的自發(fā)性和不對應性的證明

在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當長時間內(nèi)對這種抗性產(chǎn)生的原因爭論十分激烈。一種觀點認為，突變是通過適應而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對象）誘發(fā)出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對應的，并認為這就是“定向變異”另一種看法則認為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯綜在一起，所以難以探究問題的實質(zhì)。從1943年起，經(jīng)過幾個嚴密而巧妙的實驗設(shè)計，主要攻克了檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場紛爭。第7頁/共63頁變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學原理，設(shè)計了左方的實驗。1.變量試驗fluctuationtest第8頁/共63頁2.涂布試驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。第9頁/共63頁涂布試驗中突變率的計算初始接種量：5×104

個/皿培養(yǎng)5小時，繁殖了12.3代，每個微菌落約含5100個細菌這時，每個平皿上的細胞數(shù)為：5100×5×104≈2.6×108個/皿在6個平板上，比接種時增加的細胞數(shù)為：

6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個突變，故突變率=28/15.6×108=1.8×108第10頁/共63頁平板影印培養(yǎng)不僅在微生物遺傳理論的研究中有重要應用，而且在育種時間和其它研究中均有應用。3.平板影印培養(yǎng)試驗（replicaplating）第11頁/共63頁在根本未接觸過任何一點鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產(chǎn)生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。第12頁/共63頁（五）基因突變及其機制

基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點突變和畸變。具體類型可歸納如下：第13頁/共63頁1.誘發(fā)突變誘發(fā)突變（誘變）：通過人為的方法，利用物理、化學或生物因素顯著提高基因字符突變頻率的手段。誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。按照遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的特點討論幾種有代表性的誘變劑的作用機制。第14頁/共63頁（1）堿基置換（substitution）

對DNA來說，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點突變（pointmutation）。它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分類：轉(zhuǎn)換（transition；顛換（transversion

誘變劑即可同時引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機制分成以下兩類來討論。第15頁/共63頁★直接引起置換的誘變劑定義：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學反應的誘變劑，不論在機體內(nèi)或是在離體條件下均有作用。種類：例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學反應，從而引起DNA復制時堿基配對的轉(zhuǎn)換，并進一步使微生物發(fā)生變異。羥胺只引起G┇C→A:T，其余都是可使G┇C=A:T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有。第16頁/共63頁亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）

HNO2腺嘌呤（A）次黃嘌呤（H）

HNO2鳥嘌呤（G）黃嘌呤（X）這些反應及形成物均可在DNA復制中產(chǎn)生影響，主要是使堿基對發(fā)生轉(zhuǎn)換。堿基轉(zhuǎn)換的分子機制——以亞硝酸為例第17頁/共63頁亞硝酸引起的AT-GC轉(zhuǎn)換細節(jié)第18頁/共63頁第19頁/共63頁5-BU引起的轉(zhuǎn)換第20頁/共63頁從上圖中，還可以看到5-BU的摻入引起的G┇C回復到A?T的過程。通過這兩個圖示，就很容易理解為什么同一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產(chǎn)生回復突變的原因了。也可以知道，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對正在進行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。第21頁/共63頁（2）移碼突變frame-shiftmutation或phase-shiftmutation，指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shiftmutant）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。第22頁/共63頁引起移碼突變的誘變劑：主要是吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個嘌呤—嘧啶對十分相似。第23頁/共63頁丫啶類化合物的誘變機制：至今還不很清楚。有人認為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個嘌呤–嘧啶對十分相似，故能嵌入兩個相鄰DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個堿基對原來相距0.34nm，當嵌入一個丫啶分子時，就變成0.68nm），從而在DNA復制過程中，會使鏈上增添或缺失一個堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。第24頁/共63頁丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復突變圖示：第25頁/共63頁第26頁/共63頁（3）染色體畸變（chromosomalaberration）

某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點突變外，還會引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，它包括：★染色體結(jié)構(gòu)上的變化：缺失（deletion）重復（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）★染色體數(shù)目的變化第27頁/共63頁★染色體結(jié)構(gòu)上的變化分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類。染色體內(nèi)畸變：只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復時，其結(jié)果可造成基因的減少或增加；如發(fā)生倒位或易位時，則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。倒位--------是指斷裂下來的一段染色體旋轉(zhuǎn)180后，重新插入到原來染色體的原位置上，從而使其基因順序與其它的基因順序相反；易位--------是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變：指非同源染色體間的易位。第28頁/共63頁染色體畸變在高等真核生物中一般很容易觀察，但在微生物中，尤其在原核生物中，還是近年來才證實的。許多理化誘變劑的誘變作用都不是單一功能的。第29頁/共63頁由40年代B.McClintock對玉米粒色素斑點變異的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，自1967年以來，已在微生物和其它生物中得到普遍證實，并已成為分子遺傳學研究中的一個熱點。轉(zhuǎn)座：有些DNA片段不但可在染色體上移動，還可從一個染色體跳到另一個染色體，從一個質(zhì)粒跳到另一個質(zhì)?；蛉旧w，甚至還從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。在這些DNA順序的跳躍過程中，往往導致DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動或關(guān)閉，結(jié)果導致突變的發(fā)生。轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement）：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。也稱作跳躍基因（jumpinggene）或可移動基因（movablegene）。第30頁/共63頁2.自發(fā)突變機制

自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。產(chǎn)生原因：由背景輻射和環(huán)境因素引起，如天然的宇宙射線等微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應，如過氧化氫。（過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。它對Neurospora（脈孢菌）有誘變作用，這種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低，如果在加入該酶的同時又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。）由DNA復制過程中堿基配對錯誤引起。第31頁/共63頁發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線（U.V.，ultravioletray）的作用。嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡。在互補雙鏈間形成嘧啶二聚體的機會較少。但一旦形成，就會妨礙雙鏈的解開，因而影響DNA的復制和轉(zhuǎn)錄，并使細胞死亡。（六）紫外線對DNA的損傷及其修復第32頁/共63頁第33頁/共63頁定義：經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復活作用。這一現(xiàn)象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許多微生物中都得到了證實。最明顯的是在E.coli的實驗中：對照：8×106個/mlE.coliU.V. 100個/mlE.coli試驗：8×106個/mlE.coliU.V.360~490nm2×106個/mlE.coli

可見光，30min光復活作用（photoreactivation）第34頁/共63頁經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶（photoreactivatingenzyme）即光裂合酶（photolyase）結(jié)合，當形成的復合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。與此同時，光激活酶也從復合物中釋放出來，以便重新執(zhí)行功能。每一E.coli細胞中約含有25個光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在著光復活作用，所以進行紫外線誘變育種時，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。第35頁/共63頁圖:光復活作用第36頁/共63頁又稱切除修復（excisionrepair）。是活細胞內(nèi)一種用于修復被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機制。這種修復作用與光無關(guān)。有四種酶參與——①內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側(cè)切開一個3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起逐個延長，重新合成一段缺失的DNA鏈；④通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端與原鏈的5’-P末端相連接，從而完成了修復作用。暗修復作用（darkrepair）第37頁/共63頁1、由核酸內(nèi)切酶切開二聚體的5’末端，形成3’-OH和5’-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、連接酶將新合成的3’-OH與原有的5’-P相連接。第38頁/共63頁設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等紫外燈：波長為253.7nm,功率是15W處理時的照射距離：20cm~30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。

紫外誘變方法第39頁/共63頁

由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時間、菌液濃度、菌液厚度、細胞本身特性等因素有關(guān)，所以單純用時間表示照射劑量并不完全可靠。一定的死亡率必定對應一定的照射劑量，所以，在實際應用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。通常先繪制照射時間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量：死亡率為70%~80%左右。第40頁/共63頁

二、突變和育種（一）自發(fā)突變與育種生產(chǎn)過程中，微生物會以一定頻率發(fā)生自發(fā)突變。富于實際經(jīng)驗的人們就可以及時抓住這類良機來選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。育種工作者都希望自己能在最短的時間內(nèi)培育出比較理想的變異株，因此，定向培育是微生物工作者長期來的一種理想。定向培育一般指用某一特定因素長期處理某微生物的群體，以達到累積并選擇相應的自發(fā)突變株的目的。這是一種古老的育種方法，與誘變育種、雜交育種尤其是與基因工程等現(xiàn)代育種技術(shù)相比，定向培育帶有守株待兔式的被動狀態(tài)。第41頁/共63頁第42頁/共63頁第43頁/共63頁選擇選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選誘變育種工作中應考慮的幾個原則第44頁/共63頁第45頁/共63頁要求：

①菌體處于對數(shù)生長期，并使細胞處于同步生長；

②細胞分散且為單細胞，以避免表型遲延現(xiàn)象（phenotypiclag）;

表型遲延現(xiàn)象:指某一突變在DNA復制和細胞分裂后，才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無菌脫脂棉過濾。2.處理單細胞或單孢子懸液第46頁/共63頁3.誘變處理選擇簡便有效的誘變劑在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學誘變劑中，選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NT