慣用化學(xué)藥品檢驗方法

檢驗儀器使用化學(xué)藥品檢驗室常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第1頁內(nèi)容：高效液相色譜儀器（高效液相）色譜理論滴定分析法常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第2頁高效液相色譜儀一、結(jié)構(gòu)示意圖.二、部件介紹

普通由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理裝置等組成。 現(xiàn)在儀器還普通配置有在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱等。制備型HPLC儀還配置有自動餾分搜集裝置。

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第3頁泵恒壓泵、恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。當(dāng)前應(yīng)用基本上是柱塞往復(fù)泵。（單元泵、四元泵、高壓二元泵）柱塞往復(fù)泵使用時注意事項：1預(yù)防固體微粒進入泵體造成磨損。2流動相不應(yīng)含有對泵體造成腐蝕化學(xué)物質(zhì)。3泵空轉(zhuǎn)也會磨損柱塞，預(yù)防流動相跑空。4壓力過高會使密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。5預(yù)防流動相中析出鹽晶，應(yīng)開啟柱塞沖洗功效。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第4頁進樣器主要部件為定量環(huán)及六通閥。使用時應(yīng)注意：1樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以降低微粒對進樣閥磨損2進樣量應(yīng)小于定量環(huán)體積50%3每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥，現(xiàn)在大部分進樣器能自動實現(xiàn)此功效。部分自動進樣器還能實現(xiàn)柱前衍生化等操作。（Agilent）常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第5頁色譜柱色譜柱是色譜系統(tǒng)心臟。對色譜柱要求是柱效高、選擇性好、分析速度快等。使用色譜柱時應(yīng)注意事項：1防止壓力和溫度急劇改變及任何機械震動。2應(yīng)逐步改變?nèi)軇┙M成，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?普通不能反沖，不然會快速降低柱效。4使用適宜流動相（尤其是pH），以防止固定相被破壞。5流動對應(yīng)先脫氣，防止氣泡進入柱體。6測試基質(zhì)復(fù)雜樣品時，應(yīng)用保護柱。7定時用強溶劑沖洗色譜柱，去除駐留在柱內(nèi)雜質(zhì)。8保留色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇后塞緊。

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第6頁高效液相色譜主要類型及其分離原理類型（按固定相分子聚集狀態(tài)和分離機制分）：分配色譜(液-液色譜)；吸附色譜(液-固色譜)；離子交換色譜；空間排阻色譜；親和色譜等。一、液-液色譜（一）反相鍵合相色譜化學(xué)鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液官能團鍵合在載體表面特點：不易流失熱穩(wěn)定性好化學(xué)性能好載樣量大適于梯度洗脫常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第7頁1分離機制：分配+吸附

疏溶劑理論

流動相與溶質(zhì)排斥力越強，作用時間↑，k↑，組分tR↑流動相與溶質(zhì)排斥力越弱，作用時間↓，k↓，組分tR↓2．固定相：極性小烷基鍵合相

C8柱，C18柱（十八烷基Octadecylsilyl，簡稱ODS）3．流動相：極性大甲醇-水或乙腈-水

流動相極性>固定相極性（RP）底劑+有機調(diào)整劑（極性調(diào)整劑）例：水（緩沖鹽溶液）+甲醇，乙腈，THF常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第8頁4．流動相極性與k關(guān)系：

流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱次序：極性大組分先出柱極性小組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（二）正相鍵合相色譜1．分離機制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力（有分配和吸附兩種說法）2．固定相：極性大氰基、氨基、二氨基、芳硝基等鍵合相3．流動相：極性小（同LSC）底劑+有機極性調(diào)整劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第9頁4．流動相極性與k關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱次序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小組分先出柱極性大組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠柱選擇性相同（極性稍?。?，分離物質(zhì)也相同氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差異大，堿性，分析極性大物質(zhì)、酚、羧酸、核苷酸、糖類、氨基酸等（也可用作反相固定相，氨基柱不能用于分離甾酮、還原糖）常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第10頁二.液-固色譜法（或液-固吸附色譜法）1.特點：流動相為液體，固定相為吸附相。2.分離機制：Xm+nSa=Xa

+

nSmK=[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]n3.結(jié)論：顯然，分配系數(shù)大組分，吸附劑對它吸附力強，保留值就大。4.作用：a.適用分離相對分子質(zhì)量中等油性試樣。b.對含有不一樣官能團化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。

缺點：因為非線性等溫吸附常引發(fā)峰拖尾現(xiàn)象。

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第11頁三.離子交換色譜法

1.分離機制；離子與離子之間電荷吸引力

2.適用范圍；凡能在溶劑中電離物質(zhì)普通均可用該法進行分離。3.交換：KX=[-NR4+X-][Cl-]/[-NR4+Cl-][X-]DX=[-NR4+X-]/[X-]=KX[-NR4+Cl-]/[Cl-]4.結(jié)論：a.分配系數(shù)D愈大，表示溶質(zhì)離子與離子交換劑相互作用愈強。b.親協(xié)力高，在柱中保留值就愈大。

5.應(yīng)用：a.分離離子或可離解化合物。b.主要用于分析有機酸、氨基酸、核酸、多肽等。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第12頁離子對色譜法1.特點：分離效能高，分析速度快，操作簡便.

2.分離機制：又稱偶離子色譜法，是液－液色譜法分支。它是依據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改進。

3.分離過程：X+水相+Y－水相?X+Y－水相KXY=[X+Y－]有機相/[X+]水相·[Y－]水相DX=[X+Y－]有機相/X+水相=KXY·[Y－]水相4.a.可用C18、C8等慣用色譜柱；b.庚烷磺酸鈉等離子對試劑價格貴.

5.應(yīng)用：處理了以往難分離混合物分離問題.主要用于分析離子強度大酸堿物質(zhì)。（三聚氰胺）

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第13頁離子對色譜分離過程示意圖常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第14頁四、離子色譜法

1.固定相:離子交換樹脂，慣用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季銨基（陰離子交換樹脂）。流動相:電解質(zhì)溶液檢測器:電導(dǎo)檢測器，安培主配件：抑制柱2.流程圖：fig3-23.分類a.雙柱型：化學(xué)抑制型離子色譜法；b.單柱型：非抑制型，用低電導(dǎo)洗脫液；常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第15頁4.分離機制（陰離子為例）

被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中含有相同電荷離子及被測組分離子進行可逆交換，依據(jù)各離子與離子交換基團含有不一樣電荷吸引力而分離。5.應(yīng)用：

從無機和有機陰離子到金屬陽離子，從有機陽離子到糖類、氨基酸、多肽、核酸等均可用該法分析。離子色譜中發(fā)生基本過程就是離子交換，所以，離子色譜本質(zhì)上就是離子交換色譜。在離子色譜基本組成中，主要和與其它高效液相色譜不一樣就是抑制器和電導(dǎo)檢測器，離子色譜用泵是PEEK材料襯里不銹鋼泵。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第16頁藥典品種應(yīng)用離子色譜法：陽離子交換柱山梨醇及制劑甘油果糖氯化鈉注射液甘露醇及制劑利巴韋林及制劑鹽酸二甲雙胍及制劑蘋果酸及制劑富馬酸及制劑陰離子交換柱肝素鈉及制劑帕米磷酸二鈉及制劑氯膦酸二鈉及制劑硫酸軟骨素鈉及制劑色譜柱類型品種個數(shù)陽離子交換柱23個陰離子交換柱14個常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第17頁五、空間排阻色譜法

1.固定相：凝膠

2.機制：類似于分子篩作用，分離只與凝膠孔徑分布和溶質(zhì)流體力學(xué)體積和分子大小相關(guān).3.分離示意圖，fig3-3

a.排斥極限A點;b.全滲透極限B點相對分子質(zhì)量介于上述兩個極限之間化合物，將按相對分子質(zhì)量降低次序被洗脫.

4.慣用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第18頁常壓凝膠色譜頭孢尼西鈉頭孢唑肟鈉阿莫西林注射用頭孢尼西鈉注射用頭孢唑肟鈉阿莫西林膠囊頭孢他啶頭孢唑林鈉青霉素V鉀注射用頭孢他定注射用頭孢唑林鈉青霉素V鉀膠囊頭孢曲松鈉頭孢替唑鈉青霉素鈉注射用頭孢曲松鈉注射用頭孢替唑鈉注射用青霉素鈉頭孢呋辛鈉頭孢噻吩鈉青霉素鉀注射用頭孢呋辛鈉注射用頭孢噻吩鈉注射用青霉素鉀頭孢拉定頭孢噻肟鈉苯唑西林鈉頭孢哌酮鈉注射用頭孢噻肟鈉注射用苯唑西林鈉注射用頭孢哌酮鈉阿洛西林鈉美洛西林鈉氯唑西林鈉注射用阿洛西林鈉注射用美洛西林鈉注射用氯唑西林鈉普魯卡因青霉素磺芐西林鈉注射用普魯卡因青霉素注射用磺芐西林鈉藥典二部采取常壓凝膠色譜品種常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第19頁門冬酰胺酶（埃希）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度門冬酰胺酶（歐文）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度注射用門冬酰胺酶（埃希）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度注射用門冬酰胺酶（歐文）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度抑肽酶親水改性硅膠，高分子蛋白質(zhì)注射用抑肽酶親水改性硅膠，高分子蛋白質(zhì)烏司他丁親水改性硅膠，相關(guān)物質(zhì)烏司他丁溶液親水改性硅膠，相關(guān)物質(zhì)胰島素親水改性硅膠，高分子蛋白質(zhì)中性胰島素注射液親水改性硅膠，高分子蛋白質(zhì)精蛋白鋅胰島素注射液親水改性硅膠，高分子蛋白質(zhì)藥典二部采取高效凝膠色譜品種常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第20頁右旋糖酐20親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐20葡萄糖注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐20氯化鈉注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐40親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐40葡萄糖注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐40氯化鈉注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐70親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐70葡萄糖注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐70氯化鈉注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐鐵親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐鐵注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布頭孢地嗪鈉球狀蛋白色譜用親水硅膠（分子量1000~10000），相關(guān)物質(zhì)注射用頭孢地嗪鈉球狀蛋白色譜用親水硅膠（分子量1000~10000），相關(guān)物質(zhì)藥典二部采取高效凝膠色譜品種常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第21頁19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10μm無定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC被廣泛應(yīng)用于化合物分離，主要填料：粒徑為5～10μm球形硅膠。90年代早期，粒徑為5μm高純硅膠，即所謂B型硅膠被發(fā)展，并成為這個行業(yè)填料標(biāo)準(zhǔn)，這種B型硅膠含有微量金屬。90年代后期，為了滿足快速分離需求，發(fā)展了3μm或3.5μm球形硅膠，其作用和性能逐步取得了人們認同和接收。手性色譜柱開發(fā)。二十一世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速分離要求，粒徑小于2μm填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機和有機雜化硅膠。當(dāng)前，市場上流行分析用HPLC硅膠基質(zhì)填料主要為B型硅膠。填料發(fā)展史常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第22頁無定形硅膠和鍵合相硅膠示意圖：填料發(fā)展史常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第23頁色譜法應(yīng)用：液相色譜慣用檢測器光學(xué)檢測器：紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射（通用型檢測器）電化學(xué)檢測器：極譜、庫侖、安培電學(xué)檢測器：電導(dǎo)、介電常數(shù)質(zhì)譜檢測器選擇性檢測器：靈敏度較高常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第24頁檢測器類型品種個數(shù)紫外檢測器1333個蒸發(fā)光散射檢測器28個示差檢測器10個電導(dǎo)檢測器5個藥典二部采取檢測器情況常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第25頁色譜法應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測器優(yōu)點：適合用于沒有特征紫外吸收或紫外吸收很弱待測物，使用UV時靈敏度更低；無需衍生化而直接測定，防止了衍生帶來誤差。能夠應(yīng)用有強紫外吸收試劑，如氯仿、丙酮等。適合用于組分復(fù)雜樣品分析，能夠進行梯度洗脫，基線平穩(wěn)。通用型檢測器，只要待測物揮發(fā)性低于溶劑，即可適用。對不一樣物質(zhì)，ELSD對應(yīng)因子改變比其它檢測器要小得多。對環(huán)境影響不靈敏，室溫下即可操作。沒有溶劑前緣峰，適合用于保留時間短物質(zhì)檢測。與LC-MS色譜條件一致，可直接進行方法轉(zhuǎn)換。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第26頁色譜法應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測器影響ELSD響應(yīng)原因載氣流速、霧化器設(shè)計與溫度、流動相組成和流速等影響霧化過程。被分析物濃度和體積質(zhì)量決定了進入光散射池氣溶膠中顆粒直徑。被分析物折射指數(shù)、光源發(fā)出光強度和波長、光電倍增管位置等影響散射光強度。光電倍增管靈敏度和入射光強度決定了檢測效率，反應(yīng)為試驗者所觀察峰面積。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第27頁藥典二部應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測器品種妥布霉素硫酸慶大霉素妥布霉素滴眼液硫酸慶大霉素注射液硫酸妥布霉素注射液硫酸奈替米星硫酸小諾霉素硫酸奈替米星注射液硫酸小諾霉素口服溶液硫酸依替米星硫酸小諾霉素片硫酸依替米星注射液硫酸小諾霉素注射液注射用硫酸依替米星硫酸巴龍霉素硫酸核糖霉素硫酸卡那霉素注射用硫酸核糖霉素硫酸卡那霉素注射液硫酸鏈霉素硫酸卡那霉素滴眼液注射用硫酸鏈霉素注射用硫酸卡那霉素大豆磷脂硫酸西索米星膽固醇硫酸西索米星注射液蛋黃卵磷脂常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第28頁色譜法應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測器圖硫酸核糖霉素相關(guān)物質(zhì)色譜圖（蒸發(fā)管溫度：65℃，分流模式）總雜質(zhì)：5.26%常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第29頁色譜法應(yīng)用：蒸發(fā)光散射檢測器圖硫酸核糖霉素相關(guān)物質(zhì)色譜圖（蒸發(fā)管溫度：110℃，不分流模式）總雜質(zhì)：4.18%常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第30頁蒸發(fā)光散射檢測器應(yīng)用關(guān)鍵點：慎重使用，充分優(yōu)化試驗條件。企業(yè)質(zhì)控人員和藥檢所人員均需要。漂移管溫度優(yōu)化：溫度對響應(yīng)值影響無顯著規(guī)律性。最優(yōu)溫度為在流動相基本揮發(fā)基礎(chǔ)上，產(chǎn)生可接收噪音最低溫度。霧化氣流速優(yōu)化：流速越大，響應(yīng)值越低。最優(yōu)氣體流速應(yīng)是在可接收噪音基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大檢測響應(yīng)值最低氣體流速。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第31頁色譜法應(yīng)用：示差折光檢測器原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度。優(yōu)點：通用型檢測器缺點：1）對溫度改變敏感2）對溶劑組成改變敏感，不能用于梯度檢測3）屬于中等靈敏度檢測器山梨醇山梨醇注射液甘露醇甘露醇注射液乳果糖口服溶液葡甲胺麥芽糖乳糖倍他環(huán)糊精羥丙基倍他環(huán)糊精常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第32頁色譜法應(yīng)用：電導(dǎo)檢測器原理：依據(jù)物質(zhì)在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生電導(dǎo)改變來測定電離物質(zhì)含量。優(yōu)點：對流動相流速和壓力改變不敏感，可用于梯度洗脫。缺點：對溫度改變敏感（每升高1度，電導(dǎo)率增加2%-2.5%)。廣泛應(yīng)用于離子色譜。主要用于檢測水溶性無機和有機離子。帕米膦酸二鈉注射液注射用帕米膦酸二鈉鹽酸頭孢吡肟注射用鹽酸頭孢吡肟氯膦酸二鈉氯膦酸二鈉注射液氯膦酸二鈉膠囊常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第33頁幾個檢測器主要特征比較表檢測器檢測信號選擇性流速影響檢出限g/ml梯度洗脫UV吸光度有無10-10適宜FD熒光強度有無10-13適宜AD電流有有10-13不宜ELSD散射光強度無－10-9適宜RID折光率無無10-7不宜常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第34頁液相色譜法流動相1.主要性：GC載氣僅三四種，要提升柱效選擇性，主要改變固定相性質(zhì)；LC則不一樣，當(dāng)固定相選定時，流動相種類，配比能顯著地影響分離效果，所以流動相選擇很主要。2.選擇流動對應(yīng)注意原因3.溶劑選擇：a.依據(jù)：溶劑極性是主要依據(jù)。b.溶劑極性次序，水最大，正已烷最小。c.采取多元組合溶劑系統(tǒng)作為流動相（底液和洗脫液）d.依據(jù)不一樣方法選擇適當(dāng)?shù)滓汉拖疵撘?/p>

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第35頁詳細操作時還應(yīng)注意事項①流動相濾過后，注意觀察有沒有肉眼能看到微粒、纖維。有請重新濾過。②開機后把要用到管路進行purge（脫氣）處理。

③增加流速應(yīng)以0.1ml/min增量逐步進行，普通不超出0.5ml/min，反之亦然。不然易使柱床下塌。

④裝柱時注意流向，接口處不要留有空隙產(chǎn)生氣泡。

⑤樣品液請注意濾過后進樣，注意樣品溶劑揮發(fā)性。

⑥測定完成請用（甲醇：水=10:90）沖柱1小時，再用（甲醇：水=90:10）沖柱30分鐘，長時間不用應(yīng)最終再沖15分鐘純甲醇。對于含碳量高、封尾充分柱，尤其注意應(yīng)先用含5~10%甲醇水沖洗，再用甲醇沖洗。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第36頁重溫一下學(xué)校里學(xué)過色譜理論知識常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第37頁色譜法中主要參數(shù)和關(guān)系式

分配系數(shù)Kp和容量因子K'（1）分配系數(shù)Kp：定溫定壓下物質(zhì)在固定相和流動相中濃度比。

KP＝[A]s/[A]m（s－固定相；m－流動相）（2）容量因子K'：分配系數(shù)與兩相體積相關(guān)參數(shù)，表示溶質(zhì)A在兩相中質(zhì)量比。

K'=[mA]s/[mA]m=KP×VS/VmＫ`應(yīng)為1~10常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第38頁Ｒ≥１.5兩個組分能完全分開常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第39頁（3）分離度Ｒ——色譜柱總分離效能指標(biāo)

定義：相鄰兩個峰保留值之差與兩峰寬度平均值之比式中：分子反應(yīng)了溶質(zhì)在兩相中分配行為對分離影響，是色譜分離熱力學(xué)原因。分母反應(yīng)了動態(tài)過程溶質(zhì)區(qū)帶擴寬對分離影響，是色譜分離動力學(xué)原因。從中得到：兩溶質(zhì)保留時間相差越大，色譜峰越窄，分離越好。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第40頁a:柱效因子：塔板數(shù)決定，n越大，柱效越高分離越好。(色譜柱)分離度與柱效能、選擇性關(guān)系

b：選擇因子：tR’(２)與t’R（1）相差越大，r2,1越大，分越好。(樣品)C：容量因子：k’大一些對分析有利;太大，tR長；柱容量適當(dāng),分才好。(流動相)普通１＜k’＜１０常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第41頁色譜法基本理論一、塔板理論

色譜技術(shù)發(fā)展早期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中半經(jīng)驗理論－塔板理論用于色譜分析法。塔板理論把色譜柱比作一個分餾塔，假設(shè)柱內(nèi)有n個塔板，每個塔板高度稱為理論塔板高度，用H表示，在每個塔板內(nèi)，試樣各組分在兩相中分配并到達平衡，最終，揮發(fā)度大組分和揮發(fā)度小組分彼此分離，揮發(fā)度大最先從塔頂（即柱后）逸出。盡管這個理論并不完全符合色譜柱分離過程，色譜分離和普通分餾塔分離有著重大差異，不過因為這個比喻形象簡明，所以幾十年來一直沿用。一、塔板理論常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第42頁塔板理論公式H=L/n*n=5.54(tR/Wh/2)2

=16(tR/W)2

二、速率理論—范第姆特方程

用塔板理論來說明色譜柱內(nèi)各組分分離過程并不完全合理，因為色譜柱內(nèi)并沒有塔板，當(dāng)同一試樣進入同一色譜柱，當(dāng)流動相速度改變時，得到不一樣色譜圖。測得

n（塔板數(shù)）和H（柱效）也不一樣，充分說明塔板理論不足以說明色譜柱分離過程。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第43頁1956年，荷蘭學(xué)者范第姆特（VanDeomter）提出一個描述色譜柱分離過程中復(fù)雜原因使色譜峰變寬而致柱效降低（即：使H增大）影響方程。此方程經(jīng)簡化后寫為:該式稱為速率方程（范氏方程）。

u為流動相線速度cm.s-1，線速度=柱長/死時間速率理論—范第姆特方程

（1）提出了影響Ｈ三項原因：A渦流擴散項，B分子擴散項，C傳質(zhì)阻力項。（2）在流動相流速一定時，當(dāng)Ａ、Ｂ、Ｃ最小時，Ｈ小，n才最高，柱效高。當(dāng)Ａ、Ｂ、Ｃ最大時，Ｈ大，n才最小，柱效低。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第44頁（1）渦流擴散項A在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相因為受到固定相顆粒障礙，不停改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂類似“渦流”流動，故稱渦流擴散。

A＝2λdpA與填充物平均直徑dp大小和填充不規(guī)則因子λ相關(guān)。減?。粒汗潭ㄏ囝w粒應(yīng)適當(dāng)細小、填充要均勻。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第45頁待測組分是以“塞子”形式被流動相帶入色譜柱，在“塞子”前后存在濃度梯度，由濃→稀方向擴散，產(chǎn)生了縱向擴散，使色譜峰展寬。（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）

因為溶質(zhì)區(qū)帶前后存在著濃度差，因而產(chǎn)生縱向擴散使區(qū)帶（色譜峰）擴寬。因為分子在液體中擴散速率大約是在氣體中1/105，所以該項對液相色譜來說很小，而對氣相色譜則很主要。擴散嚴(yán)重是否，關(guān)鍵是取決于流動相線速度。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第46頁減小縱向擴散項Ｂ／u采取辦法（針對氣相色譜）①適當(dāng)提升流動相流速u，減小保留時間②用相對分子質(zhì)量較大氣體作流動相。

B＝2γDgDg∝③適當(dāng)降低柱溫Ｔc。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第47頁（3）傳質(zhì)阻力項Cu傳質(zhì)阻力系數(shù)C包含兩部分，Ｃ＝Ｃg+Cl兩項組成Cg—流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)

組分從流動相移動到固定相表面進行兩相之間質(zhì)量交換時所受到阻力，質(zhì)量交換慢，引發(fā)色譜峰變寬。g常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第48頁Cl—固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)

即組分從兩相界面移動到固定相內(nèi)部，達分配平衡后，又返回到兩相界面，在這過程中所受到阻力為固定相傳質(zhì)阻力。2組分在固定相中擴散系數(shù)固定液膜厚度減?。貌扇∞k法：①采取粒度小填充物；②Dl越大越好，增加柱溫是提升Dl方法之一。

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第49頁液相色譜條件試驗評價基線柱效分離度峰對稱性（T、S、AS）結(jié)果重復(fù)性（RSD）常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第50頁系統(tǒng)適用性試驗系統(tǒng)適用性試驗是在正式檢測之前進行預(yù)試驗，對當(dāng)前試驗條件所產(chǎn)生分離效果及測定結(jié)果進行評價，確認儀器狀態(tài)及試驗條件到達一定要求后才可進行有效測定。如系統(tǒng)適用性試驗達不到要求，應(yīng)對條件進行調(diào)整使最終符合要求。

藥典正文給出條件，在不改變性質(zhì)基礎(chǔ)上可按詳細試驗情況作出適當(dāng)調(diào)整,以符合系統(tǒng)適用性試驗要求。代表性質(zhì)有：色譜柱填體，流動相成份，檢測波長等。

常作出調(diào)整有：流速，流動相中水相與有機相配比等。

常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第51頁測定精度控制1.儀器狀態(tài)良好,經(jīng)過檢定/校準(zhǔn)

a.基線b.流速穩(wěn)定性c.最低檢測限d.結(jié)果重現(xiàn)性2.色譜柱狀態(tài)良好3.流動相配制

試藥選取化學(xué)純以上,最好是分析純,水用重蒸餾水,有機溶劑選取符合色譜要求試劑，流動相用前經(jīng)脫氣處理。4.合理設(shè)定參數(shù)；5.符合系統(tǒng)適用性試驗要求；6.溶液配制按容量分析要求,并注意溶液穩(wěn)定性；7.用外標(biāo)法測定時儀器最好配有定量環(huán)或自動進樣,沒有配置儀器最好選取內(nèi)標(biāo)法；8.適當(dāng)保留時間；9.其它

開頭幾份結(jié)果普通不要；對供試品色譜圖不完全了解之前應(yīng)先走一份時間較長圖譜；進行雙份平行試驗。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第52頁滴定分析法滴定分析是化學(xué)分析中一類主要分析方法。這類分析方法是將一個已知濃度液體即滴定溶液用滴定管加到被測物質(zhì)溶液中，直到所加滴定液和被測組分按化學(xué)計量反應(yīng)完全為止。優(yōu)點：精密度和準(zhǔn)確度高，操作簡便，至今仍是組分單一原料藥含量測定首選方法；快速經(jīng)濟、儀器簡單。缺點：專屬性不足，對組分較多制劑，需較繁瑣前處理，可損失一定精密度和準(zhǔn)確度。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第53頁滴定分析法

滴定分析應(yīng)符合以下條件：-a、反應(yīng)應(yīng)朝一個方向完全進行（完全、>99.9%）；-b、反應(yīng)嚴(yán)格按化學(xué)計量式進行；-c、反應(yīng)快速，必要時經(jīng)過加熱或加催化劑等方法加速反應(yīng)；-d、共存物不得干擾測定，或能用適當(dāng)方法消除；-e、確定等當(dāng)點方法簡單靈敏；-f、標(biāo)化滴定液所用基準(zhǔn)物質(zhì)易得，且符合純度高、組分恒定且與化學(xué)式符合、性質(zhì)穩(wěn)定（標(biāo)化時無副反應(yīng)）等。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第54頁滴定分析法分類依據(jù)化學(xué)反應(yīng)不一樣-分酸堿滴定、沉淀滴定、絡(luò)合滴定、氧化還原滴定；按滴定方式-分直接滴定和剩下滴定（也稱回滴定、間接滴定）。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第55頁滴定分析法操作注意事項

滴定液消耗體積：若使用50ml滴定管，最好在30～40ml范圍內(nèi)；用25ml滴定管，最好在20～25ml范圍內(nèi)，降低讀數(shù)引發(fā)得相對誤差。如：滴定管體積讀數(shù)誤差普通認為是0.02ml，假如消耗滴定液體積為10ml，則其相對誤差為0.02÷10×100％＝0.2%；體積為20ml，其相對誤差為0.1%。滴定速度：不可過快，每秒放出3～4滴為宜，即“成滴不成串”，過快液體來不及自管壁流下而致讀數(shù)不準(zhǔn)，滴定至近終點時，速度要更慢，懸掛在滴定管尖端液滴必須與錐形瓶壁接觸使之落下并用洗瓶沖洗錐形瓶壁。滴定管內(nèi)壁應(yīng)潔凈：以不掛水珠為宜，用前用滴定液少許沖洗2～3次。常用化學(xué)藥品檢驗方法檢驗儀器的使用第56頁滴定分析法操作注意事項儀器要求：所用容量儀器均應(yīng)符累計量要求，用于原料藥含量、仲裁品種、邊緣品種等測定時，應(yīng)使用帶校正值容量儀器。其校正值與標(biāo)示值之比絕對值大于0.05%時，應(yīng)在計算中采取校正值給予賠