蛋白質(zhì)印跡法WesternBlot技術(shù)第1頁(yè)/共23頁(yè)Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)

2012.12.12第2頁(yè)/共23頁(yè)Westernblot的定義Westernblot的基本原理Westernblot的一般流程Westernblot的常見(jiàn)問(wèn)題第3頁(yè)/共23頁(yè)定義印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。Westernblot又成蛋白質(zhì)印跡法，對(duì)單項(xiàng)電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱western印跡法，它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法,且能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量的分析方法。第4頁(yè)/共23頁(yè)基本原理Westernblot是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色的深度獲得特定的蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。第5頁(yè)/共23頁(yè)一般流程蛋白質(zhì)樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色第6頁(yè)/共23頁(yè)蛋白質(zhì)樣品的制備從-20℃冰箱取出細(xì)胞液，室溫溶解后，3000rpm離心5min，吸去上清液，保留細(xì)胞沉淀。每管加入一定量的上樣緩沖液裂解細(xì)胞，用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后，煮沸10min，使蛋白變性，12000rpm離心5min，取上清，測(cè)蛋白含量，用的是TCA蛋白測(cè)定法測(cè)蛋白含量。第7頁(yè)/共23頁(yè)（1）25mg/mLBSA的配制:

取0.8mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mgBSA)中，充分溶解后配制25mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也以-20℃長(zhǎng)期保存。（2）1mg/mLBSA的配制:

取BSA貯備液25mg/mL（0.1mL），用1×loadingbuffer（2.4mL）稀釋至2.5mL，按0.5mL分裝成5個(gè)包裝，標(biāo)記放入-20℃。（3）60%TCA工作液的配制:

取2.2gTCA（三氯醋酸）溶于3.67mL雙蒸水中，即為60%TCA工作液，使用前配制。（4）配制BSA標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品如表格：第8頁(yè)/共23頁(yè)BSA（μg）1mg/mLBSA(μl)1×loadingbuffer（μl）ddH2O（μl）TCA（μl）00505066.72.52.547.55066.755455066.71010405066.72020305066.73030205066.74040105066.7505005066.7第9頁(yè)/共23頁(yè)

蛋白樣品5μl，1×loadingbuffer45μl，ddH2O50μl，TCA66.7μl，放置15-30min，用酶標(biāo)儀，λ=595nm處測(cè)定蛋白含量。第10頁(yè)/共23頁(yè)

SDS電泳基本原理：在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在強(qiáng)還原劑（beta-巰基乙醇）作用下，使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合(多肽和SDS的質(zhì)量比為1:1.4)，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而消除了不同分子之間原有的電荷差異。第11頁(yè)/共23頁(yè)

蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的形狀近似于長(zhǎng)的橢圓棒，它們的短軸是恒定的，而長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量的大小成比例。因此，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)亞基分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。第12頁(yè)/共23頁(yè)電泳步驟：1.清洗玻璃板2.灌膠與上樣（1）玻璃板對(duì)齊后放在夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（2）配置10%的分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠至玻璃板高度的2／3處即可，然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（30min）。第13頁(yè)/共23頁(yè)（3）當(dāng)水與膠之間有一條明顯的折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。等三分鐘膠完全凝固后倒去上層水，并用吸水紙將水吸干。（4）按方法配置5%的濃縮膠，加入TEMED后積極搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中，待濃縮膠凝過(guò)后，兩手分別捏住梳子的兩端豎直向上輕輕將其拔出（一般20分鐘時(shí)最好拔）。

(5將裝置放入電泳槽中，加入足量的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣（電泳液至少漫過(guò)小玻璃板內(nèi)側(cè)）第14頁(yè)/共23頁(yè)（6）根據(jù)測(cè)出的蛋白含量，計(jì)算出含一定質(zhì)量蛋白的溶液體積即為上樣量。上樣前要將蛋白于沸水中煮沸10min使蛋白變性，并12000r／min離心5min。3.電泳在濃縮膠中電壓可為80V，至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后將電壓轉(zhuǎn)換為90V,電泳至溴酚藍(lán)離下邊緣1cm處時(shí)停止電泳。第15頁(yè)/共23頁(yè)轉(zhuǎn)膜1.轉(zhuǎn)一張膜需要準(zhǔn)備長(zhǎng)8.0cm，寬5.5cm的六張濾紙和一張硝酸纖維素膜。（切濾紙和膜時(shí)要戴上手套，以免手上的蛋白會(huì)污染膜）將切好的濾紙和膜至于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸兩小時(shí)才可使用。（使膜浮于轉(zhuǎn)移緩沖液上，只有下層才與水接觸，這樣由于毛細(xì)血管作用才能把整個(gè)膜浸濕。）第16頁(yè)/共23頁(yè)2.將玻璃板撬開(kāi)，去掉小玻璃板。將濃縮膠輕輕刮去，小心的剝下分離膠先放于轉(zhuǎn)移緩沖液中。（在撬玻璃板時(shí)要小心，因玻板易碎。剝離分離膠時(shí)要注意不要弄破分離膠）3.放置順序：陰極-海綿墊-三層濾紙-分離膠-膜-三層濾紙-海綿墊-陽(yáng)極。（順序不能反了，膜蓋上后不可移動(dòng)，每蓋一層，要用玻棒搟出其中的氣泡。第二、三步時(shí)戴手套，因轉(zhuǎn)移緩沖液中含甲醇，實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)空氣流通。）4.把夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，黑面對(duì)對(duì)槽的黑面，白面對(duì)槽的紅面，轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱用冰塊降溫。一般150V，400mA轉(zhuǎn)膜1：30h。5.將膜晾干備用。第17頁(yè)/共23頁(yè)封閉

用5%的脫脂奶粉封閉液（2.5g脫脂奶粉，50mlPBST緩沖液）封閉，在搖床上封閉一小時(shí)。第18頁(yè)/共23頁(yè)一抗雜交一抗稀釋液：一抗，10mlPBST，0.1g脫脂奶粉，30ul疊氮鈉。用PBST稀釋一抗至適當(dāng)濃度（一抗使用前要3000r／min離心3min）。將一抗稀釋液倒入保鮮膜袋內(nèi)，從封閉液中取出膜用濾紙吸干殘留液體，將膜放入一抗稀釋液中，膜蛋白面與抗體液面接觸。室溫下脫色搖床20min,4℃過(guò)夜。次日用PBST緩沖液室溫脫色搖床上洗三次，每次10min。第19頁(yè)/共23頁(yè)二抗雜交用同樣方法準(zhǔn)備二抗稀釋液（無(wú)疊氮鈉）并與膜接觸，室溫下孵育1h。再用PBST緩沖液洗三次，每次5min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。第20頁(yè)/共23頁(yè)底物顯色（1）將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。（2）在暗室中，取出X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果。（3）曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾，取出X-光片，先顯影液后定影液，顯影定影時(shí)間依據(jù)說(shuō)明書(shū)，最后用自來(lái)水沖去殘留的定影液，室溫晾干。第21頁(yè)/共23頁(yè)Westernblot的常見(jiàn)問(wèn)題1.膠不平：原因：1.1玻板洗刷不干凈。

1.2加入合適的