蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第1頁(yè)/共34頁(yè)第四節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第2頁(yè)/共34頁(yè)四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(一)膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)的分子量1萬(wàn)-100萬(wàn)之間，其分子直徑1-100nm之間，在膠體顆粒的范圍。蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有高度親和性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時(shí)，就很容易在蛋白質(zhì)顆粒外面形成—層水膜。

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所以蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運(yùn)動(dòng)、光散射、電泳、不能透過(guò)半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的性質(zhì)，可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等來(lái)分離純化蛋白質(zhì)，這個(gè)方法稱透析（dialysis）。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(一)膠體性質(zhì)第4頁(yè)/共34頁(yè)(二)兩性解離及等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，即能和酸作用，也能和堿作用。蛋白質(zhì)分子中可解離的基團(tuán)除肽鏈末端的-氨基和-羧基外，主要還是多肽鏈中氨基酸殘基上的側(cè)鏈基團(tuán)如-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pH條件下，這些基團(tuán)能解離為帶電基團(tuán)從而使蛋白質(zhì)帶電。

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第5頁(yè)/共34頁(yè)

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）：當(dāng)某蛋白質(zhì)在一定的pH的溶液中，所帶的正負(fù)電荷相等，它在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值叫做該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。酸性蛋白、堿性蛋白

蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)與溶液的pH有關(guān)。利用蛋白質(zhì)的兩性解離可以通過(guò)電泳分離純化蛋白質(zhì)。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(二)兩性解離及等電點(diǎn)

第6頁(yè)/共34頁(yè)蛋白質(zhì)受到某些理化因素的影響，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能隨之改變或喪失，但未導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，這種現(xiàn)象叫變性作用（denaturation）。

1.蛋白質(zhì)變性的概念2.蛋白質(zhì)變性的因素物理因素：加熱、紫外線、超聲波、高壓等；化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、脲、鹽酸胍、去垢劑、重金屬鹽等；(三)蛋白質(zhì)的變性四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第7頁(yè)/共34頁(yè)生物活性喪失（酶）；溶解度降低，粘度增大，擴(kuò)散系數(shù)變?。ǖ扒澹?；基團(tuán)位置改變；對(duì)蛋白酶敏感性增大。3.蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(三)蛋白質(zhì)的變性第8頁(yè)/共34頁(yè)4.蛋白的復(fù)性

蛋白質(zhì)的變性作用若不過(guò)于劇烈，則是一種可逆過(guò)程。高級(jí)結(jié)構(gòu)松散了的變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性(renaturation)。

大多蛋白質(zhì)變性后，很難復(fù)性。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(三)蛋白質(zhì)的變性第9頁(yè)/共34頁(yè)(四)蛋白質(zhì)的沉淀加入適當(dāng)試劑使蛋白質(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不穩(wěn)定,并將產(chǎn)生沉淀。能使蛋白質(zhì)沉淀的試劑有：1.高濃度中性鹽

（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白質(zhì)的電荷）這種加入鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，用于蛋白質(zhì)分離制備。2.有機(jī)溶劑

丙酮、乙醇

(破壞蛋白質(zhì)水膜)四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第10頁(yè)/共34頁(yè)3.重金屬鹽

Hg2+、Ag+、Pb+

（與蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)形成不易溶解的鹽,或改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)）

4.生物堿試劑苦味酸、目酸、鎢酸等

（與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團(tuán)生成不溶性鹽）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(四)蛋白質(zhì)的沉淀第11頁(yè)/共34頁(yè)(五)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)。通?？捎么朔磻?yīng)來(lái)定性鑒定蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色深淺在540nm處進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第12頁(yè)/共34頁(yè)2.酚試劑（Folin-酚試劑）反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將Folin-酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物（即鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。這一反應(yīng)常用來(lái)定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量?？筛鶕?jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色深淺在540nm處進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測(cè)定.

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(五)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)第13頁(yè)/共34頁(yè)3.茚三酮反應(yīng)由于蛋白質(zhì)多肽鏈兩端有游離的-NH2和-COOH，所以蛋白質(zhì)也可以和茚三酮發(fā)生反應(yīng)。4.考馬斯亮蘭與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成藍(lán)色透明物質(zhì)，在595nm下進(jìn)行比色。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(五)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)第14頁(yè)/共34頁(yè)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定1.蛋白質(zhì)分離、純化的過(guò)程和一般原則（1）前處理（Pretreatment）細(xì)胞破碎，蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)。（2）粗分級(jí)（Roughfractionation）當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物的提取液獲得后，選用一套適當(dāng)分離純化方法，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第15頁(yè)/共34頁(yè)1.蛋白質(zhì)分離、純化的過(guò)程和一般原則（3）細(xì)分級(jí)（Finefractionation）是將樣品進(jìn)一步提純的過(guò)程。樣品經(jīng)粗分級(jí)以后，一般體積較小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去。（4）結(jié)晶（Crystal）由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)變性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。蛋白質(zhì)純度愈高，溶液愈濃就愈容易結(jié)晶。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第16頁(yè)/共34頁(yè)2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法透析和超濾透析（dialysis）和超濾（ultrafiltration）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第17頁(yè)/共34頁(yè)2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法b.密度梯度（區(qū)帶）離心c.凝膠過(guò)濾（gelfiltration）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第18頁(yè)/共34頁(yè)四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)葡聚糖凝膠過(guò)濾第19頁(yè)/共34頁(yè)2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（2）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行分離的方法

等電點(diǎn)沉淀（isoelectricprecipitation）蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析有機(jī)溶劑分級(jí)分離四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第20頁(yè)/共34頁(yè)2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法電泳--在電場(chǎng)中，帶電顆粒向著與其帶相反電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱電泳（electrophoresis）。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第21頁(yè)/共34頁(yè)影響遷移率的因素：電位梯度電流密度導(dǎo)電性環(huán)境pH（分子電荷）離子強(qiáng)度分子的大小、形狀根據(jù)電泳的原理和影響因素可以設(shè)計(jì)不同的電泳方法以達(dá)到預(yù)期的目的四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第22頁(yè)/共34頁(yè)按分離的原理分：區(qū)帶電泳移界電泳等速電泳等電聚焦按有無(wú)支持物分：自由電泳支持物電泳四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第23頁(yè)/共34頁(yè)第一代固體介質(zhì)：紙，醋酸纖維素薄膜，硅膠等第二代固體介質(zhì)：淀粉，聚丙烯酰胺（多用于蛋白質(zhì)），瓊脂糖（多用于核酸分離）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第24頁(yè)/共34頁(yè)聚丙烯酰胺的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺增速劑：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈引發(fā)劑：過(guò)硫酸銨、過(guò)硫酸鉀、核黃素特性：機(jī)械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑大小第25頁(yè)/共34頁(yè)電泳原理：1.最主要的特性是蛋白質(zhì)的帶電行為，產(chǎn)生電荷效應(yīng)2.分子篩效應(yīng)3.分子形狀四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第26頁(yè)/共34頁(yè)2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第27頁(yè)/共34頁(yè)（3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法b.離子交換層析（ion-exchangechromatography）

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第28頁(yè)/共34頁(yè)2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法親和層析法（affinitychromatography）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第29頁(yè)/共34頁(yè)3.蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法凝膠過(guò)濾測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量凝膠過(guò)濾層析法（gelfiltrationchromatography）或稱為分子排阻層析（sizeexclusion）或分子篩層析（molecularsievechromatography）能夠測(cè)定完整的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第30頁(yè)/共34頁(yè)3.蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法(2)SDS（十二烷基硫酸鈉）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第31頁(yè)/共34頁(yè)2.蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法(3)毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量毛細(xì)管電泳（CE）則可以在很大程度上克服常規(guī)方法時(shí)間長(zhǎng)、靈敏芽低不利情況。用毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量?jī)H需要納克量蛋白質(zhì)，而且還可以用積分儀或電腦聯(lián)機(jī)精確定量。

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第