真核表達系統(tǒng)酵母絲狀真菌昆蟲哺乳動物細胞轉基因動物植物反應器酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點遺傳背景清楚（基因組是大腸桿菌的3.5倍）增殖快（90min/代），培養(yǎng)容易，產量較高易于研究突變與基因功能，如構建酵母人工染色體等可以進行轉錄和翻譯后修飾加工提純工藝復雜，成本高，制品純度達不到要求，制品免疫原性差，接種劑量大酵母載體的基本結構DNA復制起始區(qū)：2μ質粒和自主復制序列選擇標記：營養(yǎng)缺陷型和顯性選擇（抗藥）整合介導區(qū)：同源重組，決定整合位置和拷貝數(shù)有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：幫助載體平均分配表達盒轉錄啟動子終止子分泌信號序列昆蟲表達系統(tǒng)桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb啟動子：桿狀病毒科核多角體病毒的多角蛋白強啟動子表達系統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲克隆基因方法：轉移載體→共轉染→同源重組→空斑篩選→純化→重組病毒桿狀病毒表達系統(tǒng)優(yōu)點容量大：能插入12kb的外源基因高表達：polh基因啟動子是目前所知的最強的真核啟動子；產物對宿主影響?。划a物可結晶高效：可同時表達多個基因安全：桿狀病毒對脊椎動物無病原性具加工修飾功能：昆蟲細胞較高等家蠶易飼養(yǎng)哺乳動物細胞表達表達系統(tǒng)常用宿主細胞哺乳動物細胞常用載體真核細胞表達元件哺乳動物基因轉移的遺傳標記基因表達的檢測方法常用宿主細胞細胞名稱來源已投放產品BHK-21地鼠幼鼠腎凝血Ⅷ因子CHO-K1中國倉鼠卵巢tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等C127小鼠乳腺腫瘤GHMDCK長耳狗腎臟獸用疫苗NamalwaBurkitt淋巴瘤病人的類淋巴母細胞EPO，LT，tPA，IFNVero成年非洲綠猴腎HBsAg，GH鼠骨髓瘤細胞骨髓瘤tPA，抗體COSSV40轉化的綠猴腎細胞CD34，CD69，TGF真核細胞表達元件原核DNA序列啟動子增強子拼接信號終止子和多聚腺苷化信號篩選標記動物病毒基因序列原核DNA序列原核復制子抗生素抗性基因多克隆位點哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子

中常見的元件元件名稱共同序列結合的蛋白因子名稱

分子量

結合DNA長度

TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bp

Oct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp常用啟動子Rous肉瘤啟動子（RSV）巨細胞病毒啟動子（CMV）SV40啟動子增強子增強子：是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強子增強子通常占100-200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在常用增強子LTR：Rous肉瘤病毒基因長末端重復序列人類巨細胞病毒增強子SV40病毒增強子終止信號和polyA信號真核基因轉錄的終止信號與機制還不明確polyA增加mRNA的的穩(wěn)定性多聚腺苷化所需的兩種序列位于polyA下游GU豐富區(qū)或U豐富區(qū)位于polyA上游11-30bp處的5`-AAUAAASV40polyA信號遺傳性標記胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng)新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng)DHFR：真核細胞生物合成核苷酸的關鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸篩選劑：葉酸類似物——氨基喋呤或氨甲喋呤dhfr—缺陷型細胞——CHO細胞正常細胞可通過提高氨甲喋呤濃度篩選突變型dhfr基因的導入擴大篩選宿主細胞的范圍新霉素抗性基因選擇系統(tǒng)新霉素（neo）：即G418，一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質的合成新霉素抗性基因編碼3`-磷酸轉移酶降解G418適用于所有的真核細胞氯霉素乙酰轉移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)CAT：大腸桿菌Tn9轉座子編碼的催化氯霉素乙?；磻牡鞍踪|真核細胞缺乏CAT導入CAT可作為報告基因常用于瞬時表達研究構建含表位的重組體使用常用密碼子注意克隆位點（限制性酶切位點）相符5`端加上起始密碼子ATG3`端加上終止密碼子可插入蛋白酶切位點基因，以利于產生天然蛋白其他常規(guī)構建載體的注意點真核表達載體質粒：真核表達元件、真核抗性病毒載體：改建后SV40病毒腺病毒反轉錄病毒痘苗病毒猿猴空泡病毒（SV40）種屬分類：乳多空病毒科多瘤病毒屬雙鏈共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），5243bp20面體立體對稱結構，直徑45nm以EcoRl內切酶切點作為0點分成100等分，Ori點是DNA雙向復制的起紿點早期編碼進程是逆時鐘方向，在病毒DNA自制前，編碼的蛋白質(大T、小T抗原)與誘發(fā)宿主細胞的轉化有關晚期編碼區(qū)進程為順時鐘方向，是在病毒DNA復制開始以后，編碼的蛋白質為三種病毒殼體蛋白VP1、VP2和VP3，這些蛋白是病毒的結構蛋白，不參與細胞的轉化過程SV40感染細胞模式感染形式：隨宿主的不同產生的效應不同許可性細胞——裂解性感染（猿猴細胞）非許可性細胞——整合入染色體（嚙齒動物細胞）半許可性細胞——既不整合也不裂解（人細胞）SV40載體類型取代型重組病毒去掉晚期區(qū)一段DNA，外源基因可插入需輔助病毒感染可形成病毒顆粒重組病毒-質粒載體保留病毒復制相關序列插入細菌質粒序列，可在大腸桿菌種復制增殖不形成病毒顆粒SV40及衍生載體的優(yōu)點可在多種細胞中表達基因組DNA、cDNA均可表達SV40的復制起始點廣泛宿主范圍的啟動子多聚A信號DNA拼接供體和信號（剪接內含子）部分載體含有報告基因感染宿主范圍有限復制只能在猿猴細胞中載體DNA分子量小，容量小在用輔助病毒混合感染時，有野生化危險SV40及衍生載體的缺點痘苗病毒雙鏈DNA病毒180kb，編碼200種左右的蛋白可獨立的在細胞質中復制轉錄痘苗病毒載體優(yōu)越性宿主范圍廣泛容量大——插入的外源基因可達25kb瞬時表達無致癌性——本身即需接種可作為重組活疫苗的載體痘苗病毒載體的缺點分子量大，操作較困難無剪接功能——不能插入含內含子的基因外源基因必須插入非必需區(qū)構建重組痘苗病毒流程tk基因插入質粒tk基因內插入痘病毒早期啟動子接上多克隆位點接上外源基因野毒株感染細胞導入重組載體同源重組——含外源基因的tk基因取代篩選含外源基因的重組病毒感染敏感宿主細胞表達外源基因腺病毒Ad病毒顆粒的直徑為70-90nm，呈20面體立體對稱型，核心外層的殼體由252個殼粒亞單位組成雙股線型DNA，DNA約占病毒重量的11-14%不同亞型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，與其致瘤性能強弱有關Ad2基因組的早期轉錄區(qū)有6個獨立的區(qū)域:IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4Ad2基因組約長36kb，EIA和EIB與Ad2的啟動和轉化細胞密切有關腺病毒雖然分布廣泛，其中某些亞型對動物具強致瘤性，但是從A組到E組，迄今尚未證明與人類腫瘤有病因學上的聯(lián)系腺病毒載體容量較大：可插入7kb易培養(yǎng)、純化復制與轉錄依賴與宿主聚合酶不整合釋放殼體蛋白，引起免疫反應基因的導入方法光穿孔法：激光；懸浮細胞沖擊波：活體局部的基因轉移基因槍法：即微粒轟擊；動物細胞，更適用于植物細胞穿孔法：脈沖電場；Cytomix緩沖液；70%細胞死亡時效率最高磷酸鈣共沉淀法脂質體法：Lipofectin；陽離子抗體轉染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白其他：超聲波法；微注射法原生質體融合法；反轉錄病毒感染法表達產物的檢測技術Western印跡法——免疫學方法——抗原-抗體反應熒光顯微鏡法——表位標記的抗體與直接抗體進行熒光標記——免疫學方法Western印跡法蛋白樣品制備→

SDS（按分子量大小）→電轉移→一抗（特異性）→二抗→顯色敏感度：1-5ng樣品的制備裂解細胞電泳加樣緩沖液裂解細胞（煮沸5-10min）抽提細胞蛋白（超聲）SDS丙烯酰胺和N，N`-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)，形成一定孔徑的分離介質，孔徑大小由濃度決定，具有分子篩效應在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，具有濃縮效應蛋白質本身的電荷效應SDS：陰離子去污劑，與蛋白質結合SDS濃度大于0.05%時，使樣品中的蛋白質帶同樣密度的電荷電泳時使蛋白遷移只與分子量有關，且呈線性（對數(shù)分子量與遷移率），可測定分子量電轉移支持介質：重氮芐氧甲基紙（DBP紙）、陰離子化尼龍膜、硝酸纖維素膜（NC）蛋白質帶負電，向正極遷移凝膠考馬斯亮蘭染色，檢查轉移是否完全膜麗春紅染色標記分子量位置靶蛋白的免疫學檢測封閉非特異性結合位點，脫脂奶粉或血清白蛋白第一抗體：具有特異性，最好氏多抗或抗血清標記的第二抗體：同位素標記；堿性磷酸酶（AKP）標記；辣根過氧化物酶（HRP）標記注意封閉非特異性位點注意抗體濃度：尤其是一抗?jié)舛蕊@色反應AKP催化5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸與氮藍四唑發(fā)生反應，產生深藍色HRP催化3,3`-二氨基聯(lián)苯胺與H2O2反應產生棕色條帶，易褪色，注意保存結果轉基因動物概念：以動物個體為基因受體的基因表達技術，