宏因序術(shù)方

宏因測(cè)技檢標(biāo)簡(jiǎn)介：宏基因組測(cè)介紹宏基因?qū)W是以環(huán)境品中的生物群體基組為研對(duì)象，通過(guò)代基因組技手段包括功基因的選和測(cè)序分，對(duì)環(huán)中微生物多性、種結(jié)構(gòu)、化關(guān)系、功活性、互協(xié)作關(guān)系及環(huán)境間的關(guān)系進(jìn)研究的的微生研究方法。著高通測(cè)序技術(shù)的展，為基因組學(xué)研提供了的理想究方法。高量測(cè)序方法無(wú)需分環(huán)境中種微生物，無(wú)需構(gòu)克隆文就可以直接環(huán)境中有微生物進(jìn)測(cè)序。以真實(shí)客觀反映環(huán)中微生的多樣性、群結(jié)構(gòu)進(jìn)化關(guān)系等目前又以分為針對(duì)DNA/18sDNA/ITS測(cè)序和針對(duì)基因組全序的測(cè)序究。下面就對(duì)這兩的具體紹。一、DNA/18sDNA/ITS測(cè)序16sDNA是最常用的微物物種分子定的標(biāo)過(guò)對(duì)樣品中測(cè)序可鑒定其中微物物種豐度和分布況。前，普使用454平臺(tái)來(lái)環(huán)境樣品進(jìn)16sDNA序。因?yàn)镈NA列比較似，讀長(zhǎng)短的話，以進(jìn)行有效比對(duì)，454平臺(tái)平均讀在左右，以很好的避免類(lèi)問(wèn)題。二、宏基因全測(cè)序在這種序方式中，們可以定一個(gè)環(huán)境的所有生物就是一整體，然對(duì)其中所有微生物行測(cè)序。這我們就以研究樣品的功能因以及在環(huán)境中所的作用不用關(guān)心其自哪個(gè)生物?？梢袁F(xiàn)新的因，可進(jìn)行基因的測(cè)，甚有可能得到個(gè)細(xì)菌因組的全序。此外該項(xiàng)測(cè)不單可以針平，也以針對(duì)全RNA進(jìn)行因表達(dá)平的究。樣品處：宏基因樣品收集主有口腔下呼吸道痰，下呼道灌洗液，膚和糞。樣品采遵照樣品采規(guī)范（）所規(guī)定的作來(lái)進(jìn)。盡量留足份樣品

核酸提：宏基因核酸提取主有兩種法：膜過(guò)濾和直接解提取。對(duì)液體樣如痰液灌洗液兩種法都適，對(duì)于固體品如糞宜采用直接解的方。核酸提后用NanoDropND-1000定260/280=1.8-2.0，260/230=1.8-2.0，電泳檢DNA是完整一條。測(cè)序Sequencing1)16S/18S測(cè)序Sanger序：用于低量的16S/18S測(cè)序提宏基組后首通過(guò)PCR將16S/18S序列擴(kuò)出來(lái)，再將連接到隆載體上，入感受細(xì)胞，涂平做藍(lán)白篩選選陽(yáng)性克提質(zhì)粒質(zhì)粒進(jìn)測(cè)序反應(yīng)測(cè)反應(yīng)后化后ABI3130或3730進(jìn)行毛管電泳序。由于其序準(zhǔn)確率比高，而量非常低，通常用二代測(cè)序結(jié)的驗(yàn)證。454Platform454臺(tái)主要括兩種測(cè)序統(tǒng)：454FLX+System和454GSSystem454FLX+System序讀長(zhǎng)以達(dá)600-1000bp，通量450-700M，GSJuniorSystem測(cè)讀長(zhǎng)在400bp左，通量35M文庫(kù)構(gòu)：

用fusionPrimer擴(kuò)增核體RNA，將已擴(kuò)增的rRNA接做乳液PCR，GSFLX+和GS統(tǒng)上進(jìn)測(cè)序。測(cè)序深：數(shù)據(jù)分：使用免的軟件包對(duì)生物的群多樣性進(jìn)鑒定，進(jìn)行比較。1.MEGAN：一個(gè)宏因組分析工，可以大量的測(cè)序據(jù)中對(duì)序結(jié)進(jìn)行聚類(lèi)分。2.MG-RAST：于注釋基因組樣品全自動(dòng)件。3.IMG/M基于宏因組序列微物群體功能性。4.CAMERA：致力于生物生學(xué)研究。5.CARMA：可以通未拼接序列來(lái)進(jìn)行種組成微生物的遺潛力的究。6.GALAXY：用于高真核生的研究，例昆蟲(chóng)等7.GreengenesrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)可以用來(lái)做rRNA的對(duì)。8.QIIME針對(duì)454序數(shù)據(jù)的宏因組分。9.TheRibosomeDatabase（RDP針對(duì)焦酸測(cè)序的分方法。Miseq：Miseq平臺(tái)讀可以是2X250bp2X300bp使用MiseqReagentKit可以產(chǎn)7.5-8.5Gb數(shù)據(jù)，用MiseqKit可以出13.2-15Gb的數(shù)據(jù)

文庫(kù)構(gòu)：根據(jù)感趣的片段設(shè)引物，過(guò)PCR增出片做為模板構(gòu)文庫(kù)。用NexteraXTSamplePrepKit構(gòu)文庫(kù)，照試劑盒說(shuō)書(shū)操作將建好的文庫(kù)歸化處理并將混到一。在Miseq系統(tǒng)里動(dòng)進(jìn)行簇反應(yīng)，進(jìn)完成測(cè)序文庫(kù)檢：用Agilent2100檢測(cè)文庫(kù)大小段是否與預(yù)一致。庫(kù)片段是否中。測(cè)序深：16S測(cè)序深應(yīng)至少50,000條以上以保證好的覆蓋度數(shù)據(jù)分：對(duì)微生生態(tài)進(jìn)行定觀察GreengenesrRNA因數(shù)據(jù)庫(kù)和析工具宏基因分析工具：MEGAN核糖體據(jù)庫(kù)計(jì)劃(RDP)IonTorrentPlatform：Ion平臺(tái)主要有個(gè)測(cè)序系統(tǒng)IonPGM和IonSystem。IonPGM有兩種讀，200bp，IonPGM主要應(yīng)用三種片，

Ion314Chip316和IonChip最多數(shù)據(jù)產(chǎn)可以達(dá)2Gb。Ion長(zhǎng)為200bp，最多據(jù)產(chǎn)出達(dá)到10Gb。文庫(kù)構(gòu)：使用PlusFragmentLibrary為rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物加上標(biāo)簽，一共以選擇。上標(biāo)簽使用Ion?TemplateOT2200在OneTouch?DLSystem上進(jìn)行乳液PCR完成文構(gòu)建。序時(shí)根據(jù)需不同的讀長(zhǎng)擇不同測(cè)序試劑盒測(cè)序深：對(duì)于人腸道微生物rRNA測(cè)，對(duì)于檢測(cè)豐度的品，每個(gè)樣至少要測(cè)10000條，而對(duì)檢測(cè)低度的樣品，需要1,000,000以的reads。2)宏基因組測(cè)Whole-metagenomicsSequencingRoche454platform:文庫(kù)構(gòu)：提取宏因組DNA，總量低于10ug且樣品DNA應(yīng)相完整使用GSFLXTitaniumLibraryPreparationKit構(gòu)建文，按照明書(shū)進(jìn)行相操作。文庫(kù)檢：DNA數(shù)與微的比例在左右，以達(dá)到較理想的測(cè)結(jié)果。測(cè)序深：每個(gè)樣應(yīng)至少保證條以的reads數(shù)。Hiseqplatform:Hiseq平臺(tái)要有HiseqHiseq2500兩個(gè)序系統(tǒng)。Hiseq2000測(cè)序讀是2X100bpPaired-end測(cè)序，一次行通量達(dá)600Gb上，Hiseq2500兩種運(yùn)行式：快運(yùn)行和高通，快速行可以達(dá)到2X150bp，產(chǎn)生最多180Gb的數(shù)據(jù)高通量長(zhǎng)在2X125bp，數(shù)據(jù)產(chǎn)出在600Gb以上文庫(kù)構(gòu)：將提取宏基因組CovarisM220片段化后，使TruseqDNAXT/LT

SampleKit按照protocol進(jìn)行文構(gòu)建，DNA起始投入量應(yīng)在上。文庫(kù)檢：將建好宏基因組文使用

KAPAFASTABIPrism2XqPCRMasterMixBi