第一節(jié)檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)菌種

檸檬酸是一種重要的代謝產(chǎn)物，同ATP一樣是能量的標(biāo)志性物質(zhì)之一，在細(xì)胞代謝中位于三羧酸循環(huán)的起始點(diǎn)。幾乎所有的微生物都活躍地合成檸檬酸，但由于代謝調(diào)節(jié)作用，在正常情況下大多數(shù)微生物累積的量不多。所以，并非所有能產(chǎn)生檸檬酸的微生物都可以作為檸檬酸發(fā)酵的生產(chǎn)菌種。

在工業(yè)生產(chǎn)上有價(jià)值的只有幾種曲霉和幾種酵母。目前一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

1893年首先發(fā)現(xiàn)某些青霉能分泌檸檬酸，但實(shí)踐證明青霉并不適宜作為檸檬酸工業(yè)化生產(chǎn)的菌種。后來(lái)發(fā)現(xiàn)曲霉，特別是黑曲霉能分泌大量的檸檬酸。此外，棒曲霉、文氏曲霉、泡盛曲霉、芬曲霉等也能大量分泌檸檬酸。但是目前用于工業(yè)化的生產(chǎn)菌種幾乎都是黑曲霉。

以石油、乙酸、乙醇等為原料時(shí)，一般是酵母作為檸檬酸的生產(chǎn)菌種。

至今世界上消費(fèi)的檸檬酸主要采用發(fā)酵法生產(chǎn)。而最具商品競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假絲酵母等菌種的深層發(fā)酵法。目前二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)一.黑曲霉早在20世紀(jì)30年代我國(guó)老一代科學(xué)家就開(kāi)始了檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉的選育和發(fā)酵技術(shù)的研究。我國(guó)現(xiàn)有菌種適應(yīng)性強(qiáng)，生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)豐富，深層發(fā)酵檸檬酸技術(shù)目前居世界前列。我國(guó)檸檬酸生產(chǎn)以發(fā)酵狀態(tài)可分為:深層淺盤(pán)固體；

以原料可分為:糖蜜、淀粉水解糖、葡萄糖母液、淀粉、淀粉質(zhì)原料。目前三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

黑曲霉形態(tài)特征

(一)菌落與菌絲目前四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)1.察氏瓊脂培養(yǎng)基上:室溫培養(yǎng)10～14天，菌落直徑達(dá)2.5～3cm，由致密或中度疏松的白色或微黃色菌絲組成;菌絲著生豐富密集的直立分生孢子梗。菌落為碳黑色或深褐色,反面為無(wú)色或中央呈淡黃色,有霉味。2.麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上:菌落生長(zhǎng)較快,室溫下2周達(dá)5～6cm，平坦,密集遍布炭黑色孢子,反面無(wú)色或微黃,稍有霉味。分生孢子頭典型地著生于較短的分生孢子枝上,成熟時(shí)呈柱狀。目前五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)3.馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上:菌落有輻射狀溝紋,中間炭黑色,四周新生的菌絲為白色,樹(shù)枝狀。

黑曲霉形態(tài)結(jié)構(gòu)目前六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)(二)分生孢子頭

幼時(shí)呈球形,漸變?yōu)榉派湫位蛄殉啥昊蚨喟?柱狀,一般700～800μm,典型大的呈黑色,小而不典型的呈褐色,近球形,較大的不全部著色.

目前七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)(三)分生孢子梗自基質(zhì)生出,長(zhǎng)短,大小可變,一般為(1.5～3μm)×(15～20μm),壁光滑,較厚,無(wú)色或有淡褐色陰區(qū),尤其是在上半部分。(四)頂囊球形或近球形,直徑一般為(45～75μm),常有較小者,偶爾也有80μm的較大者。

目前八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)(五)小梗

雙層,褐色,遍生.初生小梗隨菌種和孢子頭成熟度而變化,成熟時(shí)有的產(chǎn)生橫隔,次生小梗較為均勻。(六)分生孢子

典型的成熟時(shí)呈球形,偶爾稍偏,不同菌株大小不同,呈褐色,壁較厚,不規(guī)則,粗糙呈現(xiàn)低度或中度突起或毛刺,不連續(xù),表面看似乎排列明顯的色條。目前九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)用的5016、3008和

G23-4菌種的基本特征

5016菌株在察氏瓊脂培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)菌落生長(zhǎng)緩慢。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，直徑為4-7cm，絨毛狀，邊緣不規(guī)則，長(zhǎng)圓形，中間凸起，棕褐色至黑色，有棕色液滴，霉味，孢子稀疏?；|(zhì)菌絲白色，表面菌絲白色，反面無(wú)色。分生孢子頭全部由基質(zhì)分出，棕褐色，球形。該菌適合于高濃度薯干粉直接發(fā)酵。目前十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

3008菌株在察氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)相當(dāng)緩慢，28℃培養(yǎng)4-5天，直徑僅僅。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，28℃培養(yǎng)7天直徑可達(dá)，分生孢子穗大量繁殖，顏色為炭黑至深褐黑色，無(wú)分泌液，反面無(wú)色。菌絲隔膜密。菌細(xì)胞短而粗，菌球體較小，該菌株更能適應(yīng)高濃度發(fā)酵。目前十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

菌株G23-4系由r-144誘變獲得。菌落為純白色，孢子油集中在菌落中央，較細(xì)小，均勻，深棕色，菌落邊緣的菌絲較長(zhǎng)、疏松、呈羽絨狀。目前十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)生活周期

黑曲霉屬半知菌綱,一般只進(jìn)行無(wú)性繁殖,由孢子發(fā)芽開(kāi)始到新孢子形成、成熟,為一個(gè)生活周期.目前十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)孢子發(fā)芽早期菌絲迅速生長(zhǎng)由足細(xì)胞生出分生孢子梗孢子梗頂端膨大成為頂囊初生小梗形成初生小梗形成孢子形成初生小梗形成黑曲霉生活周

期初生小梗形成目前十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)孢子在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8h開(kāi)始萌發(fā)出芽，長(zhǎng)出多根芽，逐漸形成菌絲，菌絲不久即出現(xiàn)分枝。黑曲霉菌絲是多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有橫隔，其中可育細(xì)胞稱(chēng)為足細(xì)胞。由足細(xì)胞長(zhǎng)出分生孢子梗，分生孢子梗頂端泡囊的聚集并與原生質(zhì)膜的融合，使頂端膨大形成頂囊，上面遍生二層小梗。小梗上長(zhǎng)出成鏈的孢子。這樣一個(gè)生活周期約50個(gè)小時(shí)。但是黑曲霉菌絲是不斷地生長(zhǎng)延長(zhǎng)的，孢子也逐漸不斷地產(chǎn)生，直至營(yíng)養(yǎng)枯竭為止。目前十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成生孢培養(yǎng)基/(g/L)發(fā)酵培養(yǎng)基/(g/L)蔗糖140140瓊脂200硝酸銨2.52.5磷酸二氫鉀1.02.5MgSO4·7H2O0.250.25Cu2+0.000480.00006Zn2+0.00380.00025Fe2+0.00220.0013Mn2+0.0010.001國(guó)外黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基目前十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)培養(yǎng)基組成生孢培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基（1）斜面培養(yǎng)基

麥芽汁10～120Bx

蔗糖2%

瓊脂2%（2）麩曲培養(yǎng)基

麥麩約70g濕麩皮/1000mL瓶（3）薯干粉16%～20%（4）玉米液化液(總糖)13%～14%NH4NO34%～5%國(guó)內(nèi)黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基目前十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)二、解脂假絲酵母

1976年酵母出現(xiàn)在檸檬酸生產(chǎn)中，烴類(lèi)是最佳碳源，所得檸檬酸產(chǎn)率最高可達(dá)14.3mg/ml。酵母的優(yōu)越性是它們的烷烴發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸能力遠(yuǎn)強(qiáng)于黑曲霉，對(duì)烷烴轉(zhuǎn)化率可達(dá)56%。主要菌種有：解脂假絲酵母、解脂腹膜胞酵母、季也蒙假絲酵母。

目前十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（一）解脂假絲酵母形態(tài)特征在麥芽汁中25℃培養(yǎng)3d,細(xì)胞呈卵形至長(zhǎng)卵形，在狹長(zhǎng)或?qū)挻蟮幕可铣鲅俊？赡艽嬖诩倬z、真菌絲及節(jié)孢子?？尚纬删?，低部可形成菌體沉淀，于17℃下培養(yǎng)1個(gè)月，則形成菌體沉淀和菌醭，不能發(fā)酵。

在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上17℃培養(yǎng)1個(gè)月,菌落呈奶油色,濕潤(rùn)或無(wú)光澤,柔軟或粗糙,有微皺或粗皺.目前十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

在馬鈴薯或玉米粉瓊脂載片培養(yǎng)時(shí),可形成豐富的假菌絲和具有橫隔的真菌絲.在真菌絲和假菌絲的頂端或中間,可見(jiàn)單個(gè)或成雙的芽生孢子,有時(shí)還存在節(jié)孢子.

（二）培養(yǎng)基解脂假絲酵母生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)基如下表：目前二十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

成分解脂假絲酵母8-2菌株

國(guó)外解脂假絲酵母

乙酸鈉葡萄糖MgS04·7H20NH4ClKH2P04

酵母膏玉米漿錦西重蠟碳酸鈣硫酸銨

0.51.03.0120604.0

40201.06.02.00.5解脂假絲酵母生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)基（g/L）目前二十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)第二節(jié)黑曲霉檸檬酸高產(chǎn)菌的

形態(tài)特征和生理特征(一)形態(tài)特征1.在麥芽汁培養(yǎng)基上菌絲白色,凸起,邊緣整齊,菌落較小,帶皺折.2.在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢,菌落邊緣整齊,分生孢子梗短,分生孢子著生較密.目前二十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)3.菌絲頂端著生稀疏的大型黑褐色孢子穗,成熟后呈開(kāi)花狀而崩裂.4.頂囊呈球形.5.小梗分兩層,初生小梗和次生小梗區(qū)別明顯，初生小梗（30～31μm）ｘ7μm，次生小梗（9

～13）μmｘ3.8μm

.6.分生孢子串珠狀著生,黑褐色,表面粗糙有明顯的刺狀突起，成熟后遇振動(dòng)易散落.目前二十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)(二)生理特征1.能耐高濃度檸檬酸（15%以上）,而不利用和分解檸檬酸。2.耐高濃度葡萄糖,能產(chǎn)生和分泌大量酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶。前者在pH2.0仍能保持原活力的80%以上，在pH2.5，40℃下作用30min尚不失活。后者在檸檬酸發(fā)酵的條件下，當(dāng)pH下降至2.0以下時(shí)，仍能保持大部分活力。3.能抗微量金屬離子,尤其能抗較高濃度的Mn2+、Cu2+、

Zn2+。4.在深層液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),能形成大量的細(xì)小菌球體。目前二十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)5.在以葡萄糖為唯一碳源的合成培養(yǎng)基上,生長(zhǎng)不好,生成小菌落,孢子形成能力弱.6.在生長(zhǎng)繁殖期,細(xì)胞內(nèi)具有較高水平的氨基酸、NH4+.7.菌絲體內(nèi)含有低水平的甘油三酯和磷酸酯.8.細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量高,但β-葡聚糖和聚半乳糖含量低.9.在生長(zhǎng)和產(chǎn)酸期,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸水平低.10.具有很強(qiáng)的側(cè)系呼吸鏈活性,此側(cè)系呼吸鏈不產(chǎn)生ATP.目前二十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)第三節(jié)黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的

選育及保藏一、黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的選育黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的選育自然選育誘變選育:不經(jīng)人工處理,利用菌種自身突變或直接從自然界中分離篩選的過(guò)程。:通過(guò)誘變劑處理來(lái)提高菌種的突變頻率,擴(kuò)大變異幅度,從中選出具有優(yōu)良性狀的突變株目前二十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（一）黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的分離選育分離篩選收集相當(dāng)數(shù)量的現(xiàn)有菌種,經(jīng)分離純化,挑選出合適的菌株。采集大量含菌樣品,分離篩選優(yōu)良菌種。目前二十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)若收集現(xiàn)有菌種則可直接活化、分離、純化，并測(cè)定每個(gè)菌株的性能，從中選出最優(yōu)良的菌株；若是通過(guò)采集含菌樣品來(lái)分離選育，可根據(jù)糖質(zhì)發(fā)酵檸檬酸高產(chǎn)菌主要是黑曲霉，它們具有強(qiáng)大的分解淀粉、蛋白質(zhì)、果膠、脂肪等物質(zhì)的酶系特征，可從腐爛植物、水果表皮，也可從含有腐爛未熟水果的酸性土壤中分離。一般講采集的含菌樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)脑鲋撑囵B(yǎng)，或?qū)悠方鱿♂屢?00mL和10%薯干粉、10%檸檬酸混合，在振蕩搖床上于33-35℃下“富集”培養(yǎng)3-5天，然后進(jìn)行分離篩選。目前二十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)麥芽汁瓊脂：適用于霉菌、酵母的分離米曲汁瓊脂：適用于霉菌、酵母的分離馬鈴薯瓊脂：適用于霉菌、酵母的分離察氏-多氏瓊脂：適用于所有霉菌，能分離較多的菌株酸性蔗糖瓊脂：抑制不耐酸的霉菌，適用于耐酸的黑曲霉分離純化酸性薯干粉平板：分離直接利用薯干粉的耐酸黑曲霉酸性淀粉平板：分離直接利用淀粉的耐酸黑曲霉酸性玉米粉平板：分離直接利用玉米粉的耐酸黑曲霉1.分離篩選(純化)培養(yǎng)基

目前二十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)2.分離篩選(純化)方法

平板劃線分離純化培養(yǎng)

前兩種方法不易一次就分離到純的黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株，要反復(fù)進(jìn)行數(shù)次。稀釋平板分離純化培養(yǎng)小滴分離純化培養(yǎng)目前三十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)分離篩選的主要原理是在平板上出現(xiàn)有單孢子形成的肉眼可見(jiàn)的單菌落中，挑選具有以下特征的菌落：（1）成熟時(shí)菌落中央稍隆起，出現(xiàn)絨毛狀覆蓋物者；（2）分生孢子梗短，分生孢子頭大，圓形黑色，老熟時(shí)開(kāi)花狀；（3）次生小梗少，大部分不分枝；可獲得單孢子的純檸檬酸生產(chǎn)菌株。目前三十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（1）平板劃線分離純化培養(yǎng)用無(wú)菌吸管取上述“富集”培養(yǎng)液于盛有無(wú)菌水及玻璃珠的三角瓶中，置于搖瓶上振蕩5分鐘，使菌懸浮于水中，將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌并冷卻后沾一環(huán)上述懸浮液于已滅菌的麥芽汁加2%瓊脂平板上，劃線后，倒置于35-37℃保溫箱中，培養(yǎng)40-44小時(shí)。挑取適當(dāng)?shù)膯我痪?，移接到麥芽汁斜面試管培養(yǎng)基上，待檢。目前三十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)1-扇形劃線法2-分區(qū)劃線法3-方格劃線法4-連續(xù)劃線法該法簡(jiǎn)單、快速、易行、理想的單菌落獲得率較低。目前三十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)取已經(jīng)滅菌的裝有9mL無(wú)菌水試管數(shù)支，做好標(biāo)號(hào)，另用無(wú)菌吸管吸取上述玻璃珠振蕩而制得的懸浮液少許，注入1號(hào)試管內(nèi)，充分的搖勻，吸取此懸浮液1mL注入第二支試管中，以此類(lèi)推，直至最后一支試管，每稀釋一管，必須更換一支無(wú)菌吸管。再?gòu)淖詈?-3支無(wú)菌試管中吸取1mL倒入融化冷卻至42-45℃的麥芽汁培養(yǎng)基中，充分搖勻，靜置凝結(jié)成平板。倒置于恒溫箱中，于35～37℃下培養(yǎng)40～48h，挑取單個(gè)菌落，移接到斜面試管培養(yǎng)基中，待檢。（2）稀釋平板分離純化培養(yǎng)目前三十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)該法簡(jiǎn)單、易行、分離的菌落較為均勻、單一，純菌獲得率大。

目前三十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（3）小滴分離純化培養(yǎng)（a）將待分離純化的孢子懸浮液接入無(wú)菌水中，經(jīng)多次稀釋至1500個(gè)活孢子/ml，用校正口徑的滴管吸取并滴布在無(wú)菌的蓋玻片上，把蓋玻片小心翻轉(zhuǎn)扣在凹形載玻片的空穴上，穴內(nèi)加一滴已滅過(guò)菌的培養(yǎng)液，蓋片與載玻片之間用凡士林密封。

小滴分離培養(yǎng)目前三十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)在顯微鏡下檢查每個(gè)小滴，記下只有一個(gè)孢子的小滴位置，把它們置于33℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2～5d，挑選出單菌落，于斜面試管培養(yǎng)基上。目前三十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)該方法操作要細(xì)、要嚴(yán)，易分離到單細(xì)胞的純菌株（b）取與培養(yǎng)皿內(nèi)徑大小相同的濾紙3～4層，浸泡在溴甲酚綠的培養(yǎng)液中，取出，放在培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋好皿蓋，一起滅菌。吸取上述稀釋好的懸浮液，點(diǎn)布在濾紙上，每皿平均點(diǎn)20～25滴，每滴約出現(xiàn)10個(gè)菌落。置于33℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2～5d，挑選出單菌落，于斜面試管培養(yǎng)基上。目前三十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)3.搖瓶篩選與性能測(cè)定搖瓶篩選挑出單一菌落麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)6-7d33℃分別接入三角瓶搖瓶發(fā)酵(初篩,復(fù)篩)篩選出產(chǎn)檸檬酸高、糖轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)酸穩(wěn)定性強(qiáng)的菌株目前三十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)性能測(cè)定抽取發(fā)酵液1mlNaOH滴定酸度0.1mol/L紙層析草酸定性檢驗(yàn)高效液相色譜分析儀產(chǎn)酸高測(cè)定檸檬酸產(chǎn)量目前四十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（二）檸檬酸生產(chǎn)菌的誘變育種

誘變育種是以強(qiáng)烈因子(物理及化學(xué))處理微生物細(xì)胞群體(或孢子),促使微生物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)(主要是DNA)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,引起誘發(fā)突變,進(jìn)而設(shè)法從大量變異群體中篩選出優(yōu)良突變株的過(guò)程.

誘變育種具有速度快、收效大、方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是檸檬酸生產(chǎn)育種常采用的一種方法。突變點(diǎn)突變?nèi)旧w突變堿基對(duì)置換碼組錯(cuò)位染色體結(jié)構(gòu)變化染色體數(shù)目變化目前四十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

凡是能提高菌種突變率的物質(zhì)稱(chēng)為誘變劑，按其性質(zhì)來(lái)分有：物理誘變劑、化學(xué)誘變劑、以及生物誘變劑三大類(lèi)。

化學(xué)誘變劑種類(lèi)很多，其中不少化合物能誘發(fā)高產(chǎn)酸菌株，效果明顯，使用最普遍的是烷化劑。化學(xué)誘變劑一般都有毒，而且很多還有致癌作用，使用時(shí)必須注意，不能直接口吸，要避免與皮膚直接接觸。目前四十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)常用誘變劑及其類(lèi)別化學(xué)誘變劑

堿基類(lèi)似物

與堿基起反應(yīng)的物質(zhì)(烷化劑,亞硝酸及羥胺)DNA分子中插入或缺失堿基的物質(zhì)(1)紫外線(UV)(2)快中子(FN)(3)X射線(4)γ射線

(60Co)(5)激光(1)2-氨基嘌呤(2-AP)(2)5-溴尿嘧啶(5-BU)(3)8-氮鳥(niǎo)嘌呤(1)硫酸二乙酯(DES)(2)甲基硫酸乙酯(EMS)(3)N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)(4)亞硝基甲基脲(NMU)(5)亞硝基乙基脲(NEU)(6)亞硝酸(NA)(7)氮芥(NM)(8)乙烯亞胺(EI)(9)羥胺(HN)(1)吖啶類(lèi)物質(zhì)(2)ICR類(lèi)化合物

噬菌體物理誘變劑

生物誘變劑ICR是美國(guó)抗癌研究所合成的吖啶類(lèi)氮芥衍生物。目前四十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)物理誘變劑和化學(xué)誘變劑的主要效應(yīng)誘變劑在DNA上的初級(jí)效應(yīng)遺傳效應(yīng)羥胺與細(xì)胞嘧啶起反應(yīng)G：CA：T轉(zhuǎn)換電離輻射堿基的羥基化和降解脫氧核糖降解核糖磷酸骨架斷裂A：TG：C轉(zhuǎn)換碼位錯(cuò)位（+和-）巨大損傷（染色體畸變）堿基類(lèi)似物摻入作用A：TG：C轉(zhuǎn)換紫外線形成嘧啶的水合物形成嘧啶二聚體G：CA：T轉(zhuǎn)換碼位錯(cuò)位（+和-）亞硝酸A、C堿基脫氨交聯(lián)A：TG：C轉(zhuǎn)換缺失烷化劑烷化堿基（主要是G）烷化磷酸基失去烷化的嘌呤骨架斷裂G：CA：T轉(zhuǎn)換A：TT：A顛換G：CC：G顛換染色體畸變吖啶類(lèi)插入DNA堿基對(duì)間碼組錯(cuò)位（+和-）目前四十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)各種化學(xué)誘變劑常用濃度、處理時(shí)間等參考資料誘變劑

誘變劑的濃度

處理時(shí)間

緩沖液中止反應(yīng)方法

亞硝酸HN02

0.01～0.1mol／L5～10min

pH4.5醋酸鹽pH8.6，0.07moL／LNaH2P04

硫酸二乙酯(DES)(C2H5)2S020．5％～l．O％(體積分?jǐn)?shù))0.1％(體積分?jǐn)?shù))15～30min30～60minpH7.0磷酸鹽硫代硫酸鈉大量稀釋

甲基磺酸乙酯(EMS)

0.05～O.5mol／L

10～60min孢子3～6minpH7.0磷酸鹽硫代硫酸鈉大量稀釋

亞硝基胍(NTG)CH3N(NO)C(NH)2N020.1～1.0mg／mL

孢子3mg／mL15～60min90～120minpH7.0磷酸鹽或Tris-HCl液大量稀釋

亞硝基甲基脲

OH3N(NO)C0NH20.1～1.0mg／mL15～90minpH7.0磷酸鹽或Tris-HCl液大量稀釋

氮芥

(C1C2H4)2NH‘HCl0.1～1.0mg／L5～10minpH6.0Tris-HCl液甘氨酸溶液大量稀釋

羥胺0.1％～5％數(shù)小時(shí)或生長(zhǎng)過(guò)程中引起突變大量稀釋

秋水仙堿

C22H25N060.01％～0.2％加入培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)程中誘變大量稀釋

氯化鋰LiCl2

0.3％～0.5％加入培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)程中誘變目前四十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)1.高產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)生菌誘變育種的步驟和方法出發(fā)菌株(根據(jù)要求認(rèn)真選擇)孢子懸浮液“濃縮”過(guò)濾培養(yǎng)麥芽汁平板分離斜面培養(yǎng)搖瓶初篩斜面培養(yǎng)搖瓶復(fù)篩斜面培養(yǎng)純化,復(fù)壯,傳代試驗(yàn)(共傳10代)生產(chǎn)條件試驗(yàn)擴(kuò)大生產(chǎn)試驗(yàn)新菌株鑒定(定名,推廣)玻璃珠打散化學(xué)誘變劑處理稀釋挑出突變菌珠(每瓶突變株平行做3瓶)(每瓶突變株3瓶)目前四十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)高產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)生菌誘變育種注意事項(xiàng)：⑴出發(fā)菌株的選擇：一般選擇具有一定的產(chǎn)酸能力但缺陷較多的菌株為出發(fā)菌株，出發(fā)菌株通常需要預(yù)先進(jìn)行單菌落分離純化，得到“純種”斜面，若菌種不純，將難獲得預(yù)期效果。⑵孢子懸浮掖的制備：因變異是發(fā)生在核中的DNA上，若一個(gè)細(xì)胞中含有許多核或許多細(xì)胞聚集成團(tuán)，那么經(jīng)誘變處理后，同一個(gè)菌落中就可能含有發(fā)生變異的，和不發(fā)生變異的成分，不利于選育。因此一般采用分散的單核細(xì)胞或孢子。目前四十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

不論采用何種誘變方法，檸檬酸產(chǎn)生菌的誘變都采用活化狀態(tài)的分散孢子進(jìn)行處理。具體操作為：

出發(fā)菌株孢子麥芽汁斜面培養(yǎng)7～8d長(zhǎng)出孢子洗下孢子液體培養(yǎng)基孢子萌發(fā)離心分離

洗滌從離心管中洗出孢子轉(zhuǎn)到小三角瓶打散孢子過(guò)濾單孢子懸浮液

菌絲斷片和沒(méi)有打散的孢子團(tuán)轉(zhuǎn)接35～37℃生理鹽水轉(zhuǎn)接振蕩培養(yǎng)4～5hpH6.0Tris緩沖液或磷酸鹽緩沖液同樣緩沖液玻璃珠振蕩宣紙或脫脂棉目前四十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)⑶具體誘變處理方法：①γ射線誘變處理：常用的γ射線源是放射性同位素60Co，γ射線照射得到變異株較多，而且獲得的遺傳性狀穩(wěn)定，可長(zhǎng)期用于生產(chǎn)，是改良檸檬酸生產(chǎn)菌種的高效方法。

γ射線處理劑量常用Gy（戈瑞）或致死率（%）表示，10-2Gy相當(dāng)于在0℃時(shí)、98kPa壓力下，能使1cm3空氣產(chǎn)生2.082ｘ109個(gè)離子對(duì)的輻射劑量。輻射劑量與與菌種細(xì)胞（孢子）的致死率具有正向的對(duì)應(yīng)關(guān)系。對(duì)于活化的孢子照射800～1200Gy，相當(dāng)于致死率為90.0%～99.9%。目前四十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

取檸檬酸產(chǎn)生菌的孢子懸浮液（含量10個(gè)/ml）20ml置于25ml比色管中，于60Coγ射線照射，劑量為800～1200Gy，照射后的孢子懸浮液稀釋成10-4，取0.1ml涂平板。采用的培養(yǎng)基為加富培養(yǎng)基，即在察氏-多氏培養(yǎng)基和酸性平板培養(yǎng)基中添加10g/L蛋白胨和酵母膏。目前五十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)②硫酸二乙酯誘變處理（孢子含量為1ｘ106個(gè)/ml)

將黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌的孢子懸浮液（孢子含量為1ｘ106個(gè)/ml）4.5ml加入2%硫酸二乙酯0.5ml于30℃下振蕩處理5min，再加入75%的硫代硫酸鈉10ml解毒10min或稀釋10倍后涂平板。目前五十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)③亞硝基胍(NTG)誘變處理

取孢子懸浮液0.9ml，于37℃恒溫水浴中預(yù)熱5min，加入0.1ml濃度為2mg/ml的亞硝基胍溶液，在水浴中保溫處理30min，取出后以3000r/min離心分離，棄去上清夜，用預(yù)先冷卻的無(wú)菌生理鹽水或緩沖液進(jìn)行洗滌離心10次以上，最后用生理鹽水恢復(fù)到原有體積后，進(jìn)行平板分離。處理之后，凡接觸過(guò)的物品都要用2mol/LNaOH液浸泡2d解毒，并用大量水沖洗。目前五十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)④高溫誘變處理:將孢子懸浮液置于高溫下處理，處理強(qiáng)度以致死率為基準(zhǔn)，一般采用80%-95%的致死率，可采用85℃、15分鐘，90℃、5分鐘，100℃、1-2分鐘，處理后進(jìn)行稀釋平板分離。

目前五十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)⑤誘變處理的新方法：復(fù)合誘變、原生質(zhì)體誘變處理。A、復(fù)合誘變：60Coγ-射線處理高溫處理亞硝基胍處理等低劑量多次復(fù)合處理的方法。B、原生質(zhì)體的誘變處理

采用蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶，先除去檸檬酸生產(chǎn)菌的細(xì)胞壁，再采用60Coγ-射線等誘變劑直接作用于原生質(zhì)體上，可增加突變率，再通過(guò)原生質(zhì)體的再生，獲得優(yōu)良性狀的菌株。

目前五十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)(4)高產(chǎn)檸檬酸突變菌株的篩選突變株的孢子懸浮液在以檸檬酸鈉為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中“濃縮”培養(yǎng)，過(guò)濾出去菌絲過(guò)濾液稀釋?zhuān)ㄟm當(dāng)濃度）指示劑顯色平板酸性薯干粉水解液平板高檸檬酸高糖察式平板高濃度Mn2+,Zn2+等金屬離子平板葡萄糖為唯一碳源合成培養(yǎng)基平板單氟乙酸平板標(biāo)記培養(yǎng)基:(培養(yǎng)3~4d)變色圈/菌落直徑大者迅速生長(zhǎng)者迅速生長(zhǎng)者生長(zhǎng)者不長(zhǎng)或少長(zhǎng)孢子者敏感者優(yōu)良新菌株挑選依據(jù):再結(jié)合菌體形態(tài)，及多次初篩、復(fù)篩目前五十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)2.高產(chǎn)檸檬酸菌種選育實(shí)例TD-01菌種的選育

TD．01菌種是天津工業(yè)微生物研究所從采集148個(gè)土樣中分離篩選出1220支單菌，產(chǎn)酸2％以上的有88株。選擇其中數(shù)株經(jīng)多次60Coγ射線的誘變處理，獲得以淀粉為原料的高產(chǎn)檸檬酸菌株，其誘變育種譜系如下：

目前五十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)TD-01菌株在2500L和4000L發(fā)酵罐中連續(xù)5批中試，平均產(chǎn)酸19.56％，周期4天，轉(zhuǎn)化率達(dá)97.28％。

目前五十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)Co827菌種的選育Co827菌種室上海工業(yè)微生物研究所，從土壤中經(jīng)酸性平板分離獲得的野生黑曲霉628作為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯和60Coγ射線等復(fù)合誘變獲得的一株高產(chǎn)檸檬酸菌株。1982年用于工業(yè)化大生產(chǎn)。它可直接利用薯干粉發(fā)酵，產(chǎn)酸達(dá)13%以上。平均轉(zhuǎn)化率為95%以上。其誘變譜系如下：目前五十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)土壤黑曲霉628酸性平板分離硫酸二乙酯處理1.8%濃度硫酸二乙酯處理40min,麥芽汁富氮培養(yǎng)基平板分離曲霉D14760Coγ射線處理，加富平板及葡萄糖合成培養(yǎng)基平板分離黑曲霉3008黑黑曲霉Co827目前五十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)二、黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的保藏方法

保藏菌種一般出于兩種情況，一是為了隨時(shí)供生產(chǎn)用，要求菌種經(jīng)常處于一定活化狀態(tài)，通常保存的是斜面菌種；另一種是為了長(zhǎng)期保存，要求菌種處于休眠狀態(tài)，一般采用砂土管、石蠟封存法和真空冷凍干燥法。保藏目的：使菌種保持活力，不致絕種。保藏條件：干燥、低溫、缺氧和缺乏養(yǎng)料等。這種適合的休眠環(huán)境條件能使菌種代謝活動(dòng)處于最低狀態(tài)，但又不至于死亡，從而達(dá)到保藏的目的。目前六十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)菌種保藏方法斜面低溫保藏法載體吸附保藏法砂土管保藏法粒狀活性炭保藏法麩曲保藏法真空冷凍干燥保藏法液氮超低溫（-196℃）保藏法根據(jù)保藏要求以及黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的特點(diǎn)，黑曲霉的保藏方法主要有以下幾種：目前六十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（一）斜面低溫保藏法

此法是生產(chǎn)中最普遍采用的一種保藏方法。操作步驟：

菌種孢子移接于麥芽汁瓊脂斜面后，于35℃下培養(yǎng)7～8天，待長(zhǎng)滿(mǎn)黑褐色孢子后，放在2～4℃冰箱中保藏，此法可保藏1～2個(gè)月。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行，容易推廣，存活率高。缺點(diǎn)：菌株仍具有一定程度的代謝活動(dòng)能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種容易發(fā)生變異和被污染。目前六十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（二）載體吸附保藏法

載體吸附保藏的原理是將菌種吸附固定在適當(dāng)?shù)妮d體上，進(jìn)行干燥保藏，通常使用的載體有砂土、麩皮、谷粒或麥粒、硅膠、粒狀活性炭、濾紙等。這些載體對(duì)菌種起著一定的保護(hù)作用。例：砂土管保藏法（1）砂土制備

不含腐殖質(zhì)土壤浸泡洗滌數(shù)次至中性烘干碾碎篩去粗粒清水篩孔為0.18mmｘ0.18mm目前六十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)河砂煮沸30min倒掉酸水沖洗至中性

烘干篩去粗粒（2）無(wú)菌砂土管制備砂與土2:3混合小試管滅菌30min冷卻保溫過(guò)夜培養(yǎng)再次滅菌（3）1mL孢子懸浮液砂土管接種針攪勻包扎干燥器真空干燥8h盛有P2O5的干燥器2～4℃冰箱10%稀鹽酸清水40目或60目篩0.15MPa蒸汽壓力目前六十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（三）真空冷凍干燥保藏法

又稱(chēng)凍干法，它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏檸檬酸產(chǎn)生菌的孢子懸浮液于安瓿（bu）管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水分升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌快。并在真空條件下立即融封，造成無(wú)氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長(zhǎng)期保存。在冷凍過(guò)程中，添加保護(hù)劑，是為避免孢子在凍結(jié)和干燥過(guò)程中死亡。黑曲霉孢子的保護(hù)劑一般采用牛、馬、羊血清或者用脫脂牛奶加1%谷氨酸鈉。

目前六十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：利用有利于菌種保藏的一切因素，使黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌的孢子始終處于低溫、干燥、缺氧的條件下。保存期可達(dá)1年至10年之久。缺點(diǎn)：操作比較繁瑣，技術(shù)要求較高，而且需要凍干機(jī)等設(shè)備。目前六十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（四）液氮超低溫（-196℃）保藏法

該方法以甘油或二甲基亞砜為黑曲霉的保護(hù)劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。-196℃遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于微生物新陳代謝作用停止的溫度（-131

℃），此時(shí)菌種的代謝活動(dòng)已經(jīng)停止，化學(xué)作用也隨之消失。

其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過(guò)渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過(guò)細(xì)胞膜外滲出來(lái)，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。目前六十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

美國(guó)ATCC菌種保藏中心采用該方法作為常規(guī)保存方法，以1

℃/min的制冷速度將菌液從0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。

如果降溫速度過(guò)快，由于細(xì)胞內(nèi)自由水來(lái)不及滲出胞外，形成冰晶就會(huì)損傷細(xì)胞。

此法操作簡(jiǎn)便、高效、保藏期可達(dá)15年以上，是目前被公認(rèn)的最有效的菌種長(zhǎng)期保藏方法。目前六十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)第四節(jié)黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的純化與復(fù)壯

檸檬酸生產(chǎn)菌種，在生產(chǎn)使用或保存的過(guò)程中可能因?yàn)樯杂胁簧?，菌種被污染；因環(huán)境條件變化和自發(fā)突變，日積月累引起菌種生產(chǎn)性能的急劇衰退，造成生產(chǎn)不正常。

菌種退化，是一種可遺傳的變異，由于基因突變、連續(xù)傳代和采用不適宜的培養(yǎng)和保藏條件等引起的，使某種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。目前六十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)檸檬酸菌種退化的病癥主要有：

(1)菌種在擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)微弱或過(guò)度旺盛，產(chǎn)孢子能力下降或喪失；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基和操作條件確信無(wú)異常情況下，產(chǎn)酸能力普遍下降；

(3)發(fā)酵液粘度升高，菌絲球形態(tài)、大小發(fā)生變化；

(4)平板分離檢查無(wú)雜菌，但菌落大小有差別或異常，甚至產(chǎn)孢子能力、孢子的顏色等也發(fā)生變化。目前七十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)引起上述病癥的原因有：①環(huán)境條件，如培養(yǎng)基成分不適，菌種保藏溫度過(guò)高；②移植菌株間歇時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分離復(fù)壯時(shí)間間隔過(guò)長(zhǎng)；③分離復(fù)壯效果差，以及雜菌的污染所致；④連續(xù)傳代次數(shù)過(guò)多，或者菌種有關(guān)基因發(fā)生自然突變或恢復(fù)突變，造成產(chǎn)酸能力下降。目前七十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)一、黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的分純

黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的分純一般采用第三節(jié)介紹的平板劃線、稀釋涂布、小滴單孢子分離等分純方法。主要原理：挑選出在平板上出現(xiàn)由單孢子形成的肉眼可見(jiàn)的，具有以下特征的菌落：（1）成熟時(shí)菌落中央稍隆起，出現(xiàn)絨毛狀覆蓋物者；（2)分生孢子梗短，分生孢子頭大，圓形黑色，老熟時(shí)開(kāi)花狀；（3）次生小梗少，大部分不分枝。

可獲得單孢子的純檸檬酸生產(chǎn)菌株。目前七十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)分純目的：除去雜菌，淘汰退化菌株，挑選高產(chǎn)優(yōu)良菌株，供生產(chǎn)使用。一般3-6個(gè)月進(jìn)行一次，若生產(chǎn)不正常，隨時(shí)進(jìn)行菌種的純化。分純方法：1.酸性平板法（簡(jiǎn)便，能完全排除雜菌干擾,得耐高濃度的檸檬酸2.變色指示圈法菌）目前七十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)1、酸性平板法A、“富集”培養(yǎng)將待分純的菌株接入15%檸檬酸和10%的薯干粉培養(yǎng)基中，置振蕩搖床上，于35℃～37℃下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落，挑到麥芽汁斜面上培養(yǎng)7～8天。B、涂平板將需分純菌株制成孢子懸浮液，適當(dāng)稀釋后，吸取0.1ml置于預(yù)先滅過(guò)菌的酸性薯干粉液化液的瓊脂平板上，用刮棒攤平，于30～33℃下培養(yǎng)3～4d，挑取長(zhǎng)出的菌落。

該法簡(jiǎn)便，能完全排除細(xì)菌、放線菌、酵母菌等雜菌的干擾，分離到較純的耐較高濃度檸檬酸的黑曲霉。目前七十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)2、變色指示圈法

需純化的菌株制成孢子懸浮液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂在含有0.04%的察氏-多氏瓊脂培養(yǎng)基制成的平板上，于30～33℃下培養(yǎng)。

由于產(chǎn)酸，菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)黃色變色圈，在變色圈尚未連成一片時(shí)，測(cè)量變色圈與菌落直徑之比，將比例大者，并具有高產(chǎn)檸檬酸形態(tài)特征的黑曲霉挑出來(lái)，移接于麥芽汁瓊脂斜面上。

將分純獲得的菌株，經(jīng)反復(fù)的搖床發(fā)酵試驗(yàn)，篩選出高產(chǎn)檸檬酸的菌株。目前七十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)二、黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌退化的預(yù)防和復(fù)壯預(yù)防方法：1.采用新鮮斜面孢子（保藏時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)）2.減少傳代（下圖2-3-2）

生產(chǎn)中使用的菌種是人工變異的高產(chǎn)菌種，這些菌種常伴隨著向野生型方向退化，而基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過(guò)程中，繁殖越頻繁，復(fù)制的次數(shù)越多，基因發(fā)生變化的機(jī)會(huì)也就越多。因此盡量避免不必要的接種和傳代，把傳代次數(shù)控制在最低水平，以降低菌種的突變幾率。

生產(chǎn)菌種的轉(zhuǎn)接，每移植一代，最好同時(shí)移植多只斜面，以供一段時(shí)間生產(chǎn)之需。一般采用下圖所示的方法。目前七十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前七十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)3.定期分離純化定期分離純化和實(shí)驗(yàn)的方法，淘汰保藏物中退化的部分和有可能污染的雜菌，確保常備的斜面孢子是無(wú)雜菌且保留有優(yōu)良性能的孢子。目前七十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

目前七十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)4.采用孢子傳代黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌的菌絲細(xì)胞常含有許多核，甚至是異核體，用菌絲接種時(shí)就會(huì)出現(xiàn)衰退和不純的子代，而孢子一般是單核的，采用孢子傳代可防止退化。5.生產(chǎn)選育

在生產(chǎn)中若遇到特別優(yōu)良發(fā)酵過(guò)程，一邊分析原因，一邊將菌絲體分離出來(lái)，經(jīng)試驗(yàn)確認(rèn)性能優(yōu)良，甚至優(yōu)于原菌種，可作為為備用菌種。目前八十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（二）黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌退化的復(fù)壯

從菌種衰退的本質(zhì)可以看出，通常在已衰退的菌種中存在有一定數(shù)量尚未衰退的個(gè)體。

從已衰退的菌種中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的方法是一種“狹義的復(fù)壯”，目前較提倡的是被稱(chēng)為“廣義復(fù)壯”的一種積極措施，即在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取菌種分離和生產(chǎn)性狀測(cè)定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。復(fù)壯方法：1.營(yíng)養(yǎng)成分引起退化的復(fù)壯

2.基因突變---向野生型退化的復(fù)壯

3.采用馴化---不經(jīng)誘變處理的復(fù)壯目前八十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)第五節(jié)黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)就是從少量的微生物原種開(kāi)始，經(jīng)過(guò)數(shù)代繁殖培養(yǎng)，為每次發(fā)酵提供相當(dāng)數(shù)量的健壯的菌種培養(yǎng)物。

黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的接種物是黑曲霉分生孢子，所以這一過(guò)程又稱(chēng)為干孢子生產(chǎn)。目前八十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

國(guó)內(nèi)檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)普遍采用：原種斜面培養(yǎng)三角瓶麩曲培養(yǎng)直接接入發(fā)酵罐種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵一級(jí)二級(jí)三級(jí)目前八十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)三角瓶麩曲孢子培養(yǎng)方式不適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)展方向，主要由于：（1）麩曲孢子需求量大，勞動(dòng)強(qiáng)度大；（2）每批孢子質(zhì)量不能保持穩(wěn)定。因此國(guó)外采用干孢子接種的先進(jìn)方法。即將優(yōu)良檸檬酸生產(chǎn)菌接種于培養(yǎng)基上，置于供給無(wú)菌空氣、保濕、保溫、密閉無(wú)菌的圓盤(pán)制曲機(jī)中進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿(mǎn)成熟的黑褐色孢子，通入35～40℃無(wú)菌空氣干燥4～5h，在無(wú)菌條件下，收集孢子并分裝于玻璃瓶?jī)?nèi)或塑料袋中密封，于5～10℃干燥條件下儲(chǔ)存。目前八十四頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)影響種子質(zhì)量的因素（1）影響斜面種子質(zhì)量因素：a.培養(yǎng)基；黑曲霉在天然培養(yǎng)基上，發(fā)育快，著生孢子色深，但產(chǎn)檸檬酸不如合成培養(yǎng)基。b.碳、氮源；對(duì)于糖蜜發(fā)酵菌種來(lái)說(shuō)，蔗糖最適宜著生孢子，麥芽糖次之，而葡萄糖和乳糖不太適宜；孢子著生受氮源影響顯著，糖蜜發(fā)酵菌種，硫酸銨促使孢子增多，但含量超過(guò)1g/L時(shí)反而減少。c.培養(yǎng)條件與時(shí)間采用蔗糖合成培養(yǎng)基，在不同培養(yǎng)條件下觀察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)孢子質(zhì)量的影響：在酸性液體培養(yǎng)時(shí)以6d為佳，而固體培養(yǎng)以6-8d適宜。固體培養(yǎng)比紙培養(yǎng)或液體培養(yǎng)效果好，酸性固體培養(yǎng)效果更好。目前八十五頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（2）影響三角瓶麩曲質(zhì)量因素：

a.麩皮質(zhì)量；b.水分；c.麩曲培養(yǎng)條件a麩皮若霉?fàn)€、蟲(chóng)咬不但給滅菌帶來(lái)困難，而且營(yíng)養(yǎng)成分減少，不利于黑曲霉生長(zhǎng)發(fā)育；麩皮若含淀粉和蛋白質(zhì)過(guò)高，黑曲霉菌絲生長(zhǎng)旺盛，但孢子著生減少；若麩皮過(guò)細(xì)，水分又過(guò)多，則麩皮松散度受影響，也不利于黑曲霉菌絲生長(zhǎng)和孢子著生。b麩曲水分過(guò)少容易形成干曲，影響黑曲霉菌絲生長(zhǎng)；水分過(guò)大影響麩曲的松散度，同時(shí)麩曲培養(yǎng)時(shí)熱量散發(fā)不出來(lái)，造成燒曲。c要保持培養(yǎng)室一定的溫度和濕度，并經(jīng)常換氣等。目前八十六頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)（3）影響種子罐種子質(zhì)量因素：

a.種子培養(yǎng)基成分；b.通風(fēng)量a采用菌絲接種時(shí)，種子罐的種子培養(yǎng)基成分比較豐富為宜。b目前廠家為了縮短種子培養(yǎng)時(shí)間，和各廠的設(shè)備條件的不同，一般采用自始自終為一個(gè)通風(fēng)量。通風(fēng)量大，能加速黑曲霉的生長(zhǎng)、繁殖、可縮短培養(yǎng)時(shí)間。目前八十七頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)第六節(jié)檸檬酸發(fā)酵機(jī)制及代謝調(diào)控檸檬酸合成是葡萄糖經(jīng)EMP、HMP途徑生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)CO2固定反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸和乙酰CoA縮合成檸檬酸。丙乙酰COA葡萄糖酮→檸檬酸酸草酰乙酸

EMP

HMP氧化脫羧

一、檸檬酸生物合成途徑CO2固定化目前八十八頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

細(xì)胞的正常代謝途徑都遵循細(xì)胞經(jīng)濟(jì)學(xué)原理并受調(diào)控系統(tǒng)的精確控制，中間產(chǎn)物一般不會(huì)超常積累。

因此，在三羧酸循環(huán)中，要使檸檬酸大量積累，就必須解決兩個(gè)基本問(wèn)題。第一，設(shè)法阻斷代謝途徑，即使檸檬酸不能繼續(xù)代謝，實(shí)現(xiàn)積累；第二，代謝途徑被阻斷部位之后的產(chǎn)物，必須有適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充機(jī)制，滿(mǎn)足代謝活動(dòng)的最低要求，維持細(xì)胞生長(zhǎng)，才能維持發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行。

檸檬酸的合成途徑如下圖所示：目前八十九頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前九十頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

在檸檬酸積累的條件下，TＣA循環(huán)已被阻斷。因此，合成檸檬酸所需的草酰乙酸必須由另外的途徑來(lái)提供。已知丙酮酸（PYR）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）均能經(jīng)催化作用固定co2而形成草酰乙酸。經(jīng)證實(shí)，在黑曲霉產(chǎn)檸檬酸階段主要是通過(guò)丙酮酸羧化酶的催化作用，使丙酮酸固定co2而形成草酰乙酸。

目前九十一頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)研究證明黑曲霉存在兩種CO2固定系統(tǒng)，兩種系統(tǒng)均需Mg2＋、K＋。其一：丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下羧化，生成草酰乙酸。PYR+CO2+ATP草酰乙酸+ADP+Pi其二：磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在PEP羧化酶作用下羧化，生成草酰乙酸。PEP+CO2+ADP+Pi草酰乙酸+ATP

這兩種酶中，其中丙酮酸羧化酶對(duì)CO2

的固定作用更大。根據(jù)檸檬酸的合成途徑，葡萄糖生成檸檬酸的總反應(yīng)式如下：2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O

目前九十二頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)

檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉在生長(zhǎng)期和產(chǎn)酸期都存在著EMP和HMP代謝。說(shuō)明葡萄糖的降解是通過(guò)兩條途徑共同完成的。但是，在生長(zhǎng)期EMP:HMP為2:1，而產(chǎn)酸期兩者的比例為4:1，即產(chǎn)酸期有80％的葡萄糖是通過(guò)EMP代謝的。這是因?yàn)樵谏L(zhǎng)期還需要通過(guò)HMP提供合成核酸等所需的前體物質(zhì)。

產(chǎn)酸期葡萄糖主要通過(guò)EMP途徑降解，對(duì)檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)是非常重要的。因?yàn)?mol葡萄糖經(jīng)EMP降解可得到2mol丙酮酸，再經(jīng)脫羧和CO2固定后，可使1mol葡萄糖合成1mol檸檬酸，這樣就能獲得較高的糖酸轉(zhuǎn)化率。目前九十三頁(yè)\總數(shù)一百零六頁(yè)\編于十七點(diǎn)檸檬酸生物合成的理想途徑

由葡萄糖發(fā)酵檸檬酸的理想途徑，即葡萄糖生成檸檬酸的碳平衡和能量代謝如圖：C6H12O6EMP途徑2×C3H4O3丙酮酸脫羧CO2固定C4﹒C2縮合C6H8O7檸檬酸丙酮酸H2O2ADP2ATP