永泰芙蓉李總多糖的分離分析作者：李雪瓊，于麗麗，陳丹，張傳鑾，年扎白姆【摘要】目的分離純化芙蓉李中的總多糖并成立其含星測定方式。方式采用水提醇沉法從芙蓉李果實中提取多糖，用大孔吸附樹脂、Scvag法等技術純化多糖，采用紙色譜法辨別多糖中單糖的種類;以多糖含星為指標，苯酚-硫酸法為測定方式，采用正交實驗法優(yōu)選最佳測定條件。結果芙蓉李粗多糖提純物中多糖平均含星為％,苯酚和硫酸的用星、反映溫度等對含星測定結果有顯著影響，而反映時間的影響較小，方式平均回收率為％,RSD為％（°二6）。結論第一次從芙蓉李中提取取得粗多糖;所成立的含星測定方式準確、靠得住，可作為其質星控制的方式?！娟P鍵詞】芙蓉李;多糖;苯酚硫酸法;含星測定Abstract:ObjectiveToisolate,purifythetotalpolysaccharidesandtoestablishamethodforassayofpolysaccharidesinFurongPolysaccharideswereextractedfromFurongplumbywaterextractionalcoholprecipitationmethod,purifiedbymacroporousadsorptionresinandSevagmethod,monosaccharidesinpolysaccharidesofFurongplumwereidentifiedbypaperchromatography.Thecontentofthepolysaccharidewasdeterminatedbyphenolsulfuricacidmethod.Orthogonaltestwasconductedtoselecttheoptimalconditionsforthedeterminationofpolysaccharide.ResultsVolumesofphonelandsulfuricacid,andreactiontemperaturehadsignificanteffectsondeterminationresuits,andreactiontimehadnosignificanteffectondeterminationresults.TheaveragecontentsofpolysaccharidesextractedfromcrudepolysaccharidespreparedfromFurongplumwas%.Therecoveryratewas99.38%with%ofRSD(n=6).ConclusionCrudepolysaccharideswereextractedfromFurongplum,andquantifiedbyphenolsulfuricacidmethodisaccurate,stable,andapplicableinthedeterminationofpolysaccharidesinFurongplum.ThemethodsmightbeusedinthequanlitycontrolthepolysaccharidesinFurongplum.Keywords:Furongplum;polysaccharides;phenolsulfuricacidmethod;assay芙蓉李(PrunussalicinaLindl.cv.Furong)為薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物李的果實，始載于《滇南本草》，又名夫人李、浦李、李實。主產于福建永泰縣梧桐鄉(xiāng)，有430連年的栽培歷史，是福建省李樹的主栽品種，其中尤以福建永泰芙蓉李道地。李子性廿、酸、苦、平，入肝、脾、腎三經，具有健胃消食的功效;其中所含活性成份具有降氣導滯、清肝滌熱、生津利水的功能;中醫(yī)用于醫(yī)治肝虛有熱、虛勞骨蒸、胃陰不足而致的口中干渴和腹水等癥［1,2〕。經課題組前期研究表明，芙蓉李中含有黃酮及其昔類成份、多糖類成份、有機酸類成份、多酚類等成份［3］。多糖普遍存在于自然界，具有多種生物活性，包括免疫調節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌、抗病毒、保護肝臟等［4、5］。目前國內外已有關于歐洲李果實中多酚及多酚抗氧化作用的研究報導［六、7］,未見有關永泰芙蓉李果實中多糖的研究，為了開發(fā)利用這一植物資源，筆者對芙蓉李中多糖進行了分離純化并辨別其中單糖的種類,運用正交設計實驗對多糖含星測定方式的條件進行了考察，并對其含星進行了測定。1儀器與試藥儀器UV9100紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）;RE52旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;4802型紫外可見分光光度計（龍尼柯上海儀器有限公司）QHAUS2140電子分析天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）。試藥芙蓉李（產地福建永泰，福建中醫(yī)學院中藥鑒定教研室范世明咼級實驗師鑒定）;無水D葡萄糖（中國藥品生物制品檢定所，110833200503）;D葡萄糖、D半乳糖、D果糖、D廿露糖（國藥集團化學試劑有限公司;AB8大孔吸附樹脂（型號D101,天津市光復精細化工研究所）;乙醇、苯酚、硫酸、苯胺、鄰苯二甲酸等試劑均為分析純。2方式與結果永泰芙蓉李粗多糖的提取分離稱取芙蓉李果1000g,剪碎，加滾水約2000mL,反復提取3次，每次1h，濾過，搜集、歸并提取液，濃縮，得芙蓉李粗多糖提取液。芙蓉李粗多糖的純化大孔吸附樹脂的預處置稱取大孔吸附樹脂1000g，用體積分數(shù)95%乙醇浸泡24h充分溶脹，裝柱后不斷用體積分數(shù)95%乙醇洗脫至流出液加水（1：5）不渾濁，改用大量蒸餾水沖洗，洗至無醇味為止，蒸餾水浸泡備用。芙蓉李多糖的純化稱取處置好的大孔吸附樹脂100g，濕法上柱。精密吸取芙蓉李提取液100mL上柱。靜置，吸附一段時間后，用蒸御水洗脫，至洗脫液對Molish反映呈陰性。搜集洗脫液，濃縮。濃縮液加乙醇使醇含星達80%,靜置24h,抽濾，濾渣依次用無水乙醇、丙酮洗滌，取得粗多糖。將粗多糖溶于水，用Scvag法除蛋白[8,9],反復進行3次至無蛋白吸收峰。多糖溶液經再次醇沉，靜置，得淺紫色絮狀沉淀，搜集沉淀，抽濾，真空干燥，即得淺灰紫色芙蓉李多糖半純品無定形粉末。 芙蓉李多糖中單糖組成的初步分析供試品溶液的制備取多糖半純品g,置10mL的安甑瓶中，加入lmol/L硫酸5mL,封瓶，100°C酸水解8h,水解液用碳酸朝中和，濾過，濾液濃縮后供紙色譜點樣用。對照品溶液的制備別離取D廿露糖、D果糖、D半乳糖、D葡萄糖等各mg,置1mL星瓶中，加蒸御水稀釋至刻度，搖勻，供點樣用。紙色譜分析將多糖酸水解供試品溶液、各單糖對照品溶液別離點樣于新華1號中速層析濾紙上，用正丁醇乙酸乙酯異丙醇乙酸毗噬水（體積比7：25：12：7：6：5）為展開劑，展開，掏出，晾干。以苯胺鄰苯二甲酸顯色，105°C烘烤10min。結果顯示芙蓉李多糖水解供試液在葡萄糖斑點出現(xiàn)的相應位置有相同的紅棕色斑點出現(xiàn)。芙蓉李多糖的含星測定對照品溶液的制備精密稱取105°C干燥至恒重的無水D葡萄糖對照品g,置I。。mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含mg的葡萄糖對照品貯備液。精密量取對照品貯備液mL，別離置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含mg的對照品溶液。供試品溶液的制備稱取干燥至恒重的芙蓉李粗多糖半純品約g，精密稱定，用少量熱水溶解，定量轉移至25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液4mL，置50mL的量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。測定波長的選擇精密量取對照品溶液和供試品溶液各2mL，按“標準曲線”項下同法操作，在400?600nm波長范圍掃描,結果顯示對照品和芙蓉李多糖在490nm波優(yōu)勢有最大吸收。吸收光譜見圖2。分析條件的選擇取供試品溶液，按“含量測定”項下同法操作，以苯酚用量、硫酸用量、反映時間和水浴溫度為考察因素卩0］，采用L9(34)正交設計實驗，別離測定吸光度，選擇最佳分析實驗條件。因素與水平及實驗結果見表1?3。表1因素水平表表2正交實驗結果表3苯酚硫酸法測定多糖顯色因素方差分析(2,18)=,(2,18)=由直觀分析及方差分析結果可知，各因素對多糖含量影響大小順序為A>B>D>C,即苯酚用量>濃硫酸用量>反映溫度>反映時間;苯酚用量、濃硫酸用量對多糖含量的影響具有極顯著性(P<；,反映溫度的影響也有顯著性(P<，反映時間的影響則沒有顯著性。綜合以上結果，肯定苯酚-硫酸法最佳分析反映條件為A1B2C1D1,即5%苯酚mL,硫酸mL,反映時間16min,反映溫度80°C。標準曲線的制備精密量取對照品貯備液0 mL,別離置50mL量瓶中,加水稀釋至刻度，搖勻。別離精密量取各溶液mL,置具塞試管中，別離加苯酚mL,搖勻，迅速加入濃硫酸mL,混勻,放置6min,80C水浴加熱5min,掏出后冰水浴中放置5min,靜置10min,以0號為空白，在490nm的波優(yōu)勢測定吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖質量濃度(Rg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=+,r=5,表明葡萄糖在2?10Rg/mL的線性范圍內呈良好的線形關系。精密度實驗別離精密吸取供試品溶液6份，按“項下同法持續(xù)操作，RSD%%。重復性實驗別離精密稱取同一批干燥至恒重的永泰芙蓉李多糖半純品6份，按“項下同法操作，測定，多糖的平均含量為％,RSD為％。顯色穩(wěn)定性實驗取同一供試品溶液，按“項下同法操作，顯色后，每隔5min測定一次吸光度。結果表明溶液在顯色45min內吸光度穩(wěn)定。加樣回收率實驗別離精密稱取同一批干燥至恒重的永泰芙蓉李總多糖半純品g6份，各精密加入葡萄糖對照品貯備液10mL，按“項制備供試液，按“項下同法操作測定吸光度，計算平均回收率和RSD值。結果見表4表4加樣回收率實驗結果含量測定精密吸取2mL供試品溶液，置具塞試管中，按“項下同法操作，測定吸光度，代入回歸方程計算，平行測定3份。總多糖平均含量％,RSD為％。3討論永泰芙蓉李總多糖可溶于水，在空氣中易吸收水分，故實驗之前均需進行干燥處置，并寄存于干燥器皿，以避免影響實驗的準確度。純化多糖的方式有多種，本實驗通過大孔吸附樹脂除去粗多糖中的黃酮類、多酚類等可溶于乙醇的成份，再通過Scvag法除去蛋白，醇沉法分離多糖，達到較好的純化效果。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，實驗操作中應注意加入的濃硫酸mL應直接迅速加到溶液表面，加酸后應充分搖勻，至顏色穩(wěn)定(1。min)后進行測定，實驗證明結果在45min內穩(wěn)定。紙色譜初步分析實驗結果表明，芙蓉李多糖主要由葡萄糖等組成，芙蓉李多糖的組成結構和生理活性尚有待進一步的深切研究。【參考文獻】張衛(wèi)明，錢學射，顧龔平，等.中國李的民族植物學皿中國野生植物資源，2004,23(4):1-3.南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典[M].上海：上?？茖W技術出版社，2006:1538-1539.于麗麗，陳丹，劉永靜，等.芙蓉李化學成份的分離分析叮福建中醫(yī)學院學報，2008,18(5):34-36.陳小燕，高澤立.多糖的研究進展——多糖對機體免疫功能的影響[J].胃腸病學和肝病學雜志,2006,15(5):540-543.[5]辛娟，王遠亮，郭莉霞，等.多糖的生物活性及其應用J].生物醫(yī)學工程研究,2004,23(10):179-182.CHUNOK,KIMDO,LEECY.Superoxideradicalscavengingactivityofthemajorpolyphenolsinfreshplums[J].JAgricFoodChem,2003,51(27):8067-8072.KIMDO,CHUNOK,KIMYJ，etofp