食品微生物學基礎實驗之二微生物染色技術第1頁/共22頁一、目的和要求1、掌握細菌涂片和染色的基本技術2、了解革蘭氏染色的機理、掌握革蘭氏染

色的方法3、掌握細菌芽孢的染色方法4、掌握無菌操作技術5、學會使用普通生物顯微鏡

第2頁/共22頁二、實驗原理1、細菌細胞微小且無色透明，在普通光學顯微鏡下不易識別，必須借助染色劑使菌體著色，增加與背景的反差，才能在顯微鏡下觀察菌體的個體形態(tài)和部分結構。因此，微生物染色是微生物學中的一項基本技術。染料能使細菌著色，并且因細菌細胞的結構和化學成分不同，而會有不同的染色反應。在一般情況下細菌菌體多帶負電荷，所以常用堿性染料進行染色。堿性染料并不是堿，和其它染料一樣是一種鹽，電離后染料離子帶正電，易與帶負電的細菌結合而使細菌著色。生物染色常用的堿性染料有結晶紫、美藍、石炭酸復紅、番紅等。

第3頁/共22頁（1）簡單染色實驗原理2、簡單染色法：是只用一種染色劑對細胞進行染色。此法操作簡便，適用于菌體的一般形態(tài)觀察，但通常不能顯示細胞構造，也不能鑒別細菌類別。染色前必須將菌體涂布于載玻片上并進行固定，其目的是殺死細菌，并使菌體粘附在載玻片上，防止菌體被染色劑沖掉。此外還可增加菌體對染料的親和力。第4頁/共22頁（2）、革蘭氏染色實驗原理

3、革蘭氏染色法(Gram

stdn)是丹麥醫(yī)生Gram于1884年創(chuàng)立的。通過這一染色，可把幾乎所有細菌分成革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌(簡寫為G+、G-)兩大類。因此它是細菌分類鑒定時的重要指標。又由于這兩大類細菌在細胞結構、成分、生理、生化、遺傳、免疫、生態(tài)及藥物敏感性方面都呈現(xiàn)出明顯的差異，因此任何細菌只要先通過簡單的革蘭氏染色，即可提供不少其它重要的生物學特征方面的信息。

第5頁/共22頁（3）芽孢染色原理

4、芽孢壁比營養(yǎng)細胞的細胞壁結構復雜而且致密，透性低，著色和脫色較營養(yǎng)細胞難。采用堿性染料并在微火上加熱，或延長染色時間，使菌體和芽孢同時染色后，用蒸餾水沖洗，脫去菌體顏色，保留芽孢的顏色。并用另一種對比鮮明的染料使菌體著色。第6頁/共22頁三、實驗材料及儀器

(一)菌種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) (二)試劑革蘭氏染色液、（草酸銨結晶紫染色液、路哥氏碘液、95％乙醇、番紅染色液）、孔雀石綠染液。

(三)其它顯微鏡，載玻片，接種環(huán)，酒精燈，香柏油，二甲苯，擦鏡紙等。第7頁/共22頁四、方法與步驟(一)制備涂片(1)涂片：取潔凈無油載玻片一塊，在其中央滴加一小滴無菌水，用接種環(huán)以無菌操作法從試管斜面取少許細菌培養(yǎng)物，在載玻片上的水滴中研開后涂成薄的菌膜(直徑約1cm)。如是液體標本，直接用接種環(huán)挑取1—2環(huán)菌液，涂布于玻片上，制成薄的菌膜。(2)干燥：將涂布的標本在室溫中自然干燥。如需加速干燥，可在酒精燈火焰上方的熱蒸汽中加溫干燥，但切勿在火焰上直接烘烤。(3)固定：手執(zhí)玻片一端，涂有菌膜的一面朝上，以其背面迅速通過火焰2—3次，略作加熱，以玻片背面觸及手背皮膚，以有熱感但不覺燙為度。第8頁/共22頁(二)染色

1、革蘭氏染色(1)初染：在涂片菌膜處滴加草酸銨結晶紫染液，染色約1—1.5min，然后用細小的水流從標本上端沖凈殘余染液(注意勿使水流直接沖洗涂菌處)，至流下的水無色為止。(2)媒染：滴加路哥氏碘液覆蓋菌膜，媒染約1—1.5min，然后用流水沖洗掉多余的碘液。用吸水紙吸干載片上的水分。(3)脫色：傾斜玻片并襯以白色背景，流滴95％乙醇沖洗涂片，同時輕輕搖動載片使乙醇分布均勻，至流出的乙醇剛剛不出現(xiàn)紫色時即停止脫色，并立即用水沖凈乙醇。(4)復染：滴加番紅染液，染色1—2min，水洗后用濾紙吸干水分。第9頁/共22頁革蘭氏染色第10頁/共22頁2、芽孢染色(1)用培養(yǎng)24h左右的斜面菌種作涂片、干燥、固定、加濾紙。(2)滴加3—5滴孔雀石綠染液于固定好的涂片上至濾紙飽和。(3)用試管夾夾住載玻片，在火焰上方徐徐加熱，保持染液冒蒸汽而不沸騰，切勿使染液蒸干，必要時應添加少許染液。從染液蒸汽開始計時，加熱4—5min。(4)傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再退色為止(5)用番紅水溶液復染1min，水洗。(6)待干燥后，置油鏡下觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色第11頁/共22頁芽孢染色第12頁/共22頁五、實驗內容（1）將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別做革蘭氏染色。（2）制備大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合涂片，并做革蘭氏染色，以進行對比。（3）制備枯草芽孢桿菌涂片，做芽孢染色。第13頁/共22頁（二）、光學生物顯微鏡的使用一、目的和要求

由于微生物的個體小，必須借助于顯微鏡將其放大才能看清楚它們的形態(tài)，所以顯微鏡的使用是微生物學的基本操作，必須認真掌握。1．了解普通生物顯微鏡的構造和性能2．正確掌握顯微鏡的使用技術和保養(yǎng)方法二、實驗材料及儀器

(一)標本片自己制作的細菌涂片(二)儀器和藥品

普通光學生物顯微鏡、鏡頭紙、香柏油、二甲苯等。第14頁/共22頁三、實驗內容

顯微鏡的構造

普通光學生物顯微鏡由機械系統(tǒng)和光學系統(tǒng)組成。

接目鏡鏡筒物鏡轉換器接物鏡載物臺聚光器鏡臂粗調螺旋細調螺旋鏡座光源電源開關光源調節(jié)器玻片推進器慮光片虹彩光圈第15頁/共22頁四、顯微鏡的保養(yǎng)

顯微鏡是精密貴重的儀器，須很好地保養(yǎng)。使用時應注意下列事項。(1)顯微鏡不能隨便拆卸，各透鏡應用鏡頭紙擦拭不得以手沾抹或用其它紙、布等擦拭，以免破壞鏡頭，沾上手印。(2)勿將顯微鏡與酸、堿及揮發(fā)性藥品放在一起。(3)避免陽光暴曬，以免在高溫下柏膠溶解或變形，使透鏡脫落。(4)顯微鏡應存放在干燥地點，雨季應在箱內放置硅膠以吸收水分。

第16頁/共22頁五、作業(yè)1、按照顯微鏡的使用方法，觀察自己制作的細菌染色涂片。2、繪制油浸鏡下所觀察到的細菌形態(tài),并注明菌名并注明放大倍數。第17頁/共22頁六、思考題

1、顯微鏡在使用時和使用后要注意哪些問題？2、為什么使用油鏡時要加一滴香柏油?第