第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準備重組及重組子的鑒定詳解演示文稿目前一頁\總數三十六頁\編于十點優(yōu)選第四五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準備重組及重組子的鑒定目前二頁\總數三十六頁\編于十點目前三頁\總數三十六頁\編于十點目前四頁\總數三十六頁\編于十點三、噬菌體的體外包裝*重組體DNA分子的轉染(transfection)作用105~106噬菌斑/gDNA*體外包裝轉導(transduction)目前五頁\總數三十六頁\編于十點天然包裝過程目前六頁\總數三十六頁\編于十點體外包裝過程尾部突變-頭頭部突變-尾E-72%E--累積尾部蛋白D-與DNA進入頭部及頭部成熟有關D--累積頭部蛋白目前七頁\總數三十六頁\編于十點四、凱倫噬菌體載體(charon)兩類特點：酶切位點多、含LacZ、容量大克隆程序:分離線性噬菌體DNA-酶切分離左右臂+中央區(qū)段-與外源DNA混合-包裝幾kb~23kb噬菌體載體及派生載體的優(yōu)點：感染效率高目前八頁\總數三十六頁\編于十點五、柯斯質粒載體1、柯斯質粒載體的構建定義：(cossite-carryingplasmid)eg.pHC79(+pBR322)cos+與噬菌體包裝有關的序列ori+Ampr+Tetr容量：31~45kb目前九頁\總數三十六頁\編于十點目前十頁\總數三十六頁\編于十點2、柯斯質粒載體的特點*具有噬菌體的特性（環(huán)化）*具有質粒載體的特性*高容量3、柯斯克隆優(yōu)點：容量大、非重組體少問題：分子內重組成多聚體（堿性磷酸酶處理）基因間連接（電泳分級分離）目前十一頁\總數三十六頁\編于十點目前十二頁\總數三十六頁\編于十點六、單鏈DNA噬菌體載體*M13、f1、fd*優(yōu)點：雙鏈復制型、單雙鏈均可轉染宿主、顆粒大小受DNA多寡制約、易測出插入方向*M13克隆體系特性：LacZ、誘導及組成型的LacZ、成對構建（M13mp8、M13mp9）

目前十三頁\總數三十六頁\編于十點目前十四頁\總數三十六頁\編于十點七、噬菌體展示載體(phagedisplay)絲狀噬菌體（M13/fd)表面-3~5拷貝geneIII產物-顆粒組裝及F性須吸附G.P.Smith-1985建立-在噬菌體表面表達蛋白應用：噬菌體表面展示文庫*原理*分離hGH變體目前十五頁\總數三十六頁\編于十點目前十六頁\總數三十六頁\編于十點目前十七頁\總數三十六頁\編于十點目前十八頁\總數三十六頁\編于十點八、噬菌粒載體(phasmid)M13類的缺陷：-插入后遺傳穩(wěn)定性下降，且與片段大小有關-實際上總以正向插入-容量有限（1500bp）改進的M13類-噬菌粒-分子小：3kb-容量10kb-雙向性（細菌質粒和phage）目前十九頁\總數三十六頁\編于十點目前二十頁\總數三十六頁\編于十點T3+T7目前二十一頁\總數三十六頁\編于十點1、噬菌體載體的類型及其比較。2、噬菌體的體外包裝原理。3、什么是凱倫噬菌體載體？有怎樣的特點？4、什么是柯斯質粒載體？有怎樣的特點？5、單鏈DNA噬菌體載體的優(yōu)點。6、噬菌體展示載體的工作原理。7、噬菌粒載體的特點。復習提綱目前二十二頁\總數三十六頁\編于十點第五章目的基因的準備、重組及重組子的鑒定一、cDNA基因文庫的構建（匯集生物體所有cDNA序列的重組DNA群體）1、cDNA基因文庫的優(yōu)點：病毒RNA篩選簡單表達測定基因結構（內含子外顯子）、時間調節(jié)基因表達特征分析2、缺點：無調節(jié)序列低豐度mRNA克隆難目前二十三頁\總數三十六頁\編于十點

Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g)特異mRNA拷貝數/總mRNA種類可克隆片段大小/基因組總長度mRNA豐度克隆基因的大小(載體容量)10670/29%=87000N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x105目前二十四頁\總數三十六頁\編于十點3、RNA的制備及純化總RNA的提取mRNA的純化-oligodT-纖維素柱層析特異mRNA的富集（mRNA分級分離、蔗糖密度梯度離心）特異mRNA的分析鑒定*mRNA體外翻譯（麥胚、兔網織紅細胞）*RNA電泳-NorthernBlot目前二十五頁\總數三十六頁\編于十點4、cDNA兩鏈的合成5、雙鏈cDNA分子與載體的連接*同聚物加尾*linker-連接子6、重組體導入宿主轉化、轉染、電脈沖目前二十六頁\總數三十六頁\編于十點RNaseH方法目前二十七頁\總數三十六頁\編于十點Self-priming目前二十八頁\總數三十六頁\編于十點同聚物加尾目前二十九頁\總數三十六頁\編于十點重組-linker目前三十頁\總數三十六頁\編于十點二、cDNA基因文庫的篩選與特異重組體的鑒定1、遺傳檢測*利用載體提供的表型特征*插入基因功能表達2、物理檢測*凝膠電泳目前三十一頁\總數三十六頁\編于十點3、核酸探針（screeningalibrary)目前三十二頁\總數三十六頁\編于十點4、免疫化學檢測*標記抗體探針*免疫沉淀5、轉譯篩選法*雜交抑制的轉譯-豐富mRNA*雜交選擇的轉譯-低豐度mRNA-insulin6、正負篩選法組織特異性、發(fā)育階段特異性、特殊處理后基因表達差異目前三十三頁\總數三十六頁\編于十點目前三十四頁\總數三十六頁\編于十點三、基因組DNA文庫的構建與篩選1、基因組DNA文庫：匯集生物體所有DNA序列的重組DNA群體2、目的研究結構基因及其調控序列基因組結構3、目的基因的準備*限制酶切法-鳥槍法(shot-gun