關于實驗同源重組第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

內容一、什么是Red/ET同源重組二、技術的特點 三、作用機制 四、功能元件 五、操作流程及關鍵因素 六、在基因工程中的主要應用 七、新技術的發(fā)展八、在其他細菌中的應用 第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

遺傳重組基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個恰到好處的平衡，這樣才能使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差異主要由兩種機制產生，一種是突變，一種是遺傳重組。第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月?重組可分為四類（DNA序列、蛋白質因子）?狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內斷裂-復合的基因交流?遺傳重組與重組DNA技術異常廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過程第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、什么是Red/ET同源重組1.概念Red/ET重組是新近出現的一種利用來自E.coli中λ

噬菌體的重組酶Redα/Redβ

或者是來自Rac噬菌體的重組酶RecE/RecT進行基因同源重組的DNA工程技術。2.原理首先重組酶沿5’→3’方向消化雙鏈DNA，露出粘性末端（15-50bp）。隨后重組酶介導單鏈退火修復（single-strandannealing），即載體和插入片段的黏性末端（15-50bp）互補形成穩(wěn)定的帶缺刻的環(huán)狀重組質粒，轉化大腸桿菌后能自動被修復為閉合的環(huán)狀質粒

第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月3.特點：

Red同源重組技術具有同源序列短(15～50bp)、重組效率高、操作簡單、快速的特點。4.應用

這種技術可在DNA靶標分子的任意位點進行基因敲除、敲入、點突變等操作,無需使用限制性內切酶和連接酶。此外,這種新型重組技術可直接將目的基因克隆到載體上,目的基因既可來源于細菌人工染色體也可是基因組DNA。Red同源重組技術使難度較大的基因工程實驗順利進行,大大推動功能基因組研究的發(fā)展。第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月gbalphageETRacphageRacrecE/recT

操縱子=λ

red

操縱子,操縱子中的重組酶（Redα/Redβ

或者RecE/RecT）協(xié)同配合完成重組作用；recE=redα

：5’→3’dsDNA核酸外切酶；

recT=redβ

：ssDNA結合和退火蛋白；

redγ：防止E.coli中的核酸酶RecBCD對外源線性DNA片段的消化。λ噬菌體的pL操縱子示意圖

第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Reda(RecE)Red同源重組原理示意圖Single-strandannealingStrandinvasion3’5’DigestionBinding3’5’Redb(RecT)Repair/ReplicationSelection第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月RecE/RecT和Redα/Redβ兩重組系統(tǒng)的差異“線狀DNA＋線狀DNA”重組，選用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；“線狀DNA＋環(huán)狀DNA”重組，選用Redα/Redβ重組酶系統(tǒng)；

根據需要選擇含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的誘導型啟動子（pBAD、pTet）的重組酶系統(tǒng)表達質粒。質粒:pSC101-BAD-gbaA(amp)pSC101-BAD-gbaA(tet)pSC101-BAD-gbaA(hyg)pSC101-Tet-gbaA(tet)pSC101-BAD-ETgA(tet)pSC101-Tet-ETgA

(amp)第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月RecE/RecT和Redα/Redβ兩重組系統(tǒng)對不同類型底物重組效率的差異第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Red同源重組技術相關文獻第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月NatureGenetics(1998)NatureBiotechnology(2000)第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月1.不依賴RecA蛋白，在重組酶系統(tǒng)（Redα/Redβ或RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供體DNA分子能直接重組到受體DNA分子上，實現替換、插入、刪除、突變等；2.不受靶標DNA分子大小的限制；3.不受內切酶切位點的限制；4.精確性：不依賴RecA蛋白，減少了引入非預期的突變、缺失、替換等的幾率；

5.簡便快捷：省去了中間質粒的構建，減少實驗步驟、縮短實驗周期。二、Red/ET同源重組技術的特點第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、Red/ET重組的作用機制Red/ET重組鏈入侵模型1.鏈入侵模式第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Red/ET同源重組鏈退火模型2.鏈退火模型第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月四、Red/ET重組中的功能元件1.Redα、Redβ和RedγRedα：以三聚體的形式形成“漏斗型”活性的蛋白，5’-3’外切酶活性。Redα結構（A）和與DNA相互作用的模式（B）（圖片來自Subramanianetal.2003）

Redβ：與ssDNA結合形成絲狀體，催化與互補ssDNA之間的退火。

Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶對外源DNA的降解。第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2.RecE和RecTRecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，對5’端為羥基的底物也有活性。RecT：與ssDNA結合形成絲狀體，催化與互補ssDNA之間的退火。3.RecA

４個亞基形成有活性的RecA蛋白，細菌中廣泛存在且高度保守，有同源重組酶、DNA損傷修復、DNA依賴ATPase活性等功能?？烧T導SOS反應、挽救DNA復制叉等，提高電擊后細胞的活力，增加電轉化效率。第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月五、Red/ET重組操作流程引物設計合成線性供體dsDNA底物的制備線性載體的制備重組反應重組產物轉化至感受態(tài)細胞重組子篩選重組子檢測第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月1.設計合成引物

設計引物時要遵循一般引物設計的基本原則，但是上下游引物要加上15-20bp的載體同源序列。載體同源序列如何添加主要分以下兩種情況：（1）載體酶切后是5’端突出或平末端，則引物上的同源序列包括5’端突出序列的同源序列。（2）載體酶切后是3’端突出，則引物上的同源序列不包括3’端突出序列的同源序列。第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設計方法第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月同源臂長度對Red/ET重組效率的影響（數據來自Zhangetal.1998）

同源臂的長度在15～50bp時，重組效率就能滿足實驗要求，重組效率隨著同源臂長度的增加而增加。第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2.線性供體dsDNA底物的制備

選用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，減少PCR反應中的突變；擴增GC含量較高的DNA片段時，選用Triplemaster、HotStarTaq等），用合成的引物PCR擴增獲得dsDNA底物；純化PCR產物：（1）減少模板背景對篩選工作帶來的難度；（2）降低其剩余引物與靶標DNA片段的結合，提高重組效率；（3）去處PCR產物中的鹽離子，提高轉化效率。降低模板對篩選工作帶來的難度；

（1）純化回收PCR產物；（2）內切酶消化處理模板；（3）使用R6K復制子。第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月線性化載體可以通過酶切或PCR擴增兩種方法獲得。1）酶切

選取合適的位點，單酶切或雙酶切皆可,質粒的線性化不徹底，將導致陰性克隆的產生，為了提高陽性率，建議通過雙酶切進行質粒線性化。2）PCR擴增

選取合適的位點，設計正向和反向引物，引物長度一般在18-20bp左右，建議用高保真的聚合酶擴增。為了避免模板質粒DNA對后續(xù)試驗的影響，建議用DpnI內切酶消化PCR產物，降低背景，提高陽性率。不管采取哪種方法，最終線性化載體的濃度需>50ng/ul，高濃度的載體有利于提高效率。

3.線性載體的制備第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月4.同源重組反應試劑加量10xBuffer1ulRecombinationEnzyme1ul線性化載體（>50ng/ul）

50-100ng插入片段（>50ng/ul）150-200ngddH2O補足至10ul（1）配置反應體系

將目的DNA片段和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進行重組反應（摩爾比可計算方法見附錄），10ul體系(見下表)注意：1.目的片段與載體的摩爾比在2:1-5:1之間，摩爾比低于2:1效率會降低；2.反應時間在15-30分鐘，時間太短不利于重組反應（2）短暫離心混勻，37℃孵育15分鐘。（3）反應結束后，取5-10ul反應液立即進行轉化，剩余反應液可在4℃或-20℃保存待用。

第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月5.重組產物轉化至感受態(tài)細胞冰上融化一管100μl的DH5α感受態(tài)細胞。加入5-10μl反應液到感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰上孵育30分鐘。42℃水浴中熱激45-90秒后，冰浴3分鐘。注意：所使用的感受態(tài)細胞效率≥1×108cfu/μg.加入890μlSOC液體培養(yǎng)基，37℃復蘇45-60分鐘。第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月6.重組子篩選

復蘇培養(yǎng)物8000rpm離心1分鐘收集菌體，根據需要將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上,37℃倒置培養(yǎng)12-16h后觀察菌落生長情況。使用抗生素的最低抑菌濃度，有利于獲得更多的重組子：在10μg/mL的卡那霉素平板上重組子的數目是60μg/mL的卡那霉素平板上重組子的數目的6倍。

抗生素使用濃度與Red/ET重組效率的關系

第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月常用抗生素的工作濃度第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月7.重組子的檢測

檢測方法：酶切分析、PCR檢測、平板雙劃線、測序等；

一般采用菌落PCR進行陽性克隆鑒定。為避免假陽性結果，鑒定引物選擇一條為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。高拷貝質粒修飾存在“質粒多聚體”現象；“質粒多聚體”問題解決辦法：采用“線性DNA+線性DNA”重組方式；利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；減低質?？截悢怠５?9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月卡那霉素抗性基因（Kan）替換pUC19中的氨芐抗性基因（Amp）“質粒多聚體”現象解決辦法：采用“線性DNA+線性DNA”重組方式；利用RecE/RecT重組酶系統(tǒng)；減低質?？截悢?。第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月六、Red/ET重組技術的主要應用1.重組質粒的構建2.染色體的修飾3.亞克?。⊿ubcloning）4.直接克隆（Directcloning）第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月1.重組質粒的構建(1)傳統(tǒng)基因克隆技術的缺點

傳統(tǒng)克隆技術依賴限制性酶切位點和內切酶的消化，當缺少合適的酶切位點或者某個酶切位點在目的片段中大量存在時，利用內切酶消化難以得到相應的產物。方法看似簡單，但實驗周期長。大片段難以與載體正確連接。無法同時連接多個（2個以上）的DNA片段。限制性內切酶連接酶第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月步驟1：酶切目的片段步驟2：酶切載體步驟3:目的片段與載體連接同源重組克隆步驟傳統(tǒng)克隆步驟步驟4:重組子轉化到感受態(tài)細胞第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月同源重組克隆傳統(tǒng)克隆克隆片段長度50bp-10kb50bp-2kb一次克隆片段數1-5個1個感受態(tài)效率要求1×108cfu/ug以上1×107cfu/ug以上所用的酶重組酶T4連接酶片段的插入位點任何位點特定位點片段酶切不需要需要載體線性化方法酶切或PCR酶切同源重組克隆與傳統(tǒng)克隆比較第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月插入選擇標記插入無選擇標記的DNA片段2.染色體的修飾第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月E.coli染色體上插入抗性基因第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

傳統(tǒng)基因工程技術（A）和Red/ET重組技術（B）修飾E.coli染色體實驗步驟比較第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月（B）不同復制子能承載外源DNA片段的大小3.亞克?。⊿ubcloning）4.直接克?。―irectcloning）（A）亞克隆和直接克隆示意圖第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Red/ETsubcloning亞克隆pGB-15A載體抗性基因簇第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于202