高效液相色譜法1.高效液相色譜法2.

HPLC與GC差別3.

HPLC的分類和基本原理4.設(shè)備配置

高效液相色譜法5.固定相6.液相色譜的流動(dòng)相高效液相色譜法(highpressureLiquidchromatography，HPLC)是利用物質(zhì)在兩相之間吸附或分配的微小差異達(dá)到分離的目的。當(dāng)兩相作相對(duì)移動(dòng)時(shí)，被測物質(zhì)在兩相之間做反復(fù)多次的分配，這樣使原來微小的差異產(chǎn)生了很大的分離效果，達(dá)到分離、分析和測定一些理化常數(shù)的目的。

高效液相色譜法與氣相色譜比較高效液相色譜以溶劑作流動(dòng)相，流動(dòng)相參與分離作用，分離能力強(qiáng)；適用范圍廣，氣相色譜分離分析的化合物只占化合物的30％，而高效色譜對(duì)高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、大分子量、離子型化合物等都有效，適合于生命物質(zhì)的分析；分析過程中一般不破壞物質(zhì)，因而可以方便地制備色譜純物質(zhì)。HPLC與GC差別HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓填料顆粒大柱效低分析速度慢色譜柱只用一次不能在線檢測高壓，40～50Mpa填料顆粒小，2～50μm柱效高，40000～60000塊/m分析速度快色譜柱可重復(fù)多次使用能在線檢測一、HPLC的分類和基本原理

色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。高效液相色譜法按固定相的名稱可分為液－液色譜和液－固色譜，按分離機(jī)制的不同分為：液固吸附色譜法液液分配色譜法（正相與反相）離子交換色譜法離子對(duì)色譜法分子排阻色譜法一、HPLC的分類和基本原理HPLC有以下特點(diǎn)：高壓——壓力一般100~300kg/cm2。高速——流速為1~10ml/min。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達(dá)10-10g/L。同時(shí)消耗樣品少。高效——可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種適用范圍廣——可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質(zhì)或受熱不穩(wěn)定的物質(zhì)二、設(shè)備配置

高壓輸液系統(tǒng)(輸液泵)、進(jìn)樣系統(tǒng)(進(jìn)樣器)、分離系統(tǒng)(色譜柱)和檢測系統(tǒng)(檢測器)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，高壓泵將貯液器中流動(dòng)相經(jīng)過進(jìn)樣器，將樣品帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號(hào)記錄下來，得到液相色譜圖。液相色譜儀器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色譜儀（1）液相色譜儀（2）液相色譜儀（4）流程及主要部件

（processandmainassemblyofHPLC）梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到。三、固定相HPLC固定相骨架顆粒材料可分為無機(jī)和有機(jī)兩類，無機(jī)類中應(yīng)用最多的是硅膠，其他如多孔玻璃、羥基磷灰石、石墨炭黑等。有機(jī)類主要為有機(jī)高分子合成材料，最為常見的是交聯(lián)聚苯乙烯，其他常用的還有高交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚乙烯吡啶和交聯(lián)聚乙醇等。三、固定相1.固定相的特性①較細(xì)的顆粒。一般為5～10μm。②粒度均勻一致。③機(jī)械強(qiáng)度好，具有良好的耐高壓剛性。④如果為多孔性顆粒，則孔徑分布也要均勻。⑤化學(xué)和熱穩(wěn)定性好，耐酸堿，不容易產(chǎn)生不可逆吸附。

(薄殼型微珠擔(dān)體)30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底。2.固定相的分類1）液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁和多孔聚合物；結(jié)構(gòu)類型：全多孔高效吸附劑、全多孔低效吸附劑和表面多孔吸附劑。(1)硅膠分為薄殼玻璃珠、無定形全多孔硅膠及堆積硅珠等類型。(2)氧化鋁分為球形和無定形兩種，粒度5～10μm。對(duì)不飽和的碳?xì)浠衔锖秃u素化合物的分離效果較好。在硅膠上吸附太強(qiáng)的化合物可試用氧化鋁。(3)多孔聚合物以聚苯乙烯膠體為代表，在pH1～14中穩(wěn)定。特點(diǎn)是選擇性好、峰形好，但硬度不高。2)液-液分配色譜固定相(1)正、反相色譜流動(dòng)相極性小于固定相的分配色譜法稱為正相色譜法。以含水的硅膠為固定相，烷烴為流動(dòng)相的色譜法是正相液-液分配色譜的代表。正相色譜法主要靠組分的極性差別分離，適用于含有不同官能團(tuán)物質(zhì)的分離。流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相色譜法。在進(jìn)行反相洗脫時(shí)，樣品中極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱，主要分離對(duì)象是極性小的物質(zhì)。

3)離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂

薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）4)空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑。（3）硬質(zhì)凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植?。（2）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相是應(yīng)用最廣的色譜法。將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相，其特點(diǎn)是不流失，一般認(rèn)為有分配與吸附兩種功能。

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣

c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N（2）化學(xué)鍵合固定相≡Si-O-Si-C鍵型鍵合相，按極性分為非極性、極性和中性三種類型。中等極性鍵合相較少使用。A.非極性鍵合相非極性鍵合相又稱反相鍵合相，其表面基團(tuán)為非極性烴基，如十八烷基、辛烷基、乙基、甲基和苯基鍵合相。代表產(chǎn)品是十八烷基硅烷-硅膠，是最常用的非極性鍵合相。鍵合相優(yōu)點(diǎn)是使用過程中不流失、熱穩(wěn)定性好、適于剃度洗脫等，其流動(dòng)相常用甲醇-水或乙腈-水，主要分離對(duì)象是非極性或弱極性化合物。（2）化學(xué)鍵合固定相B.極性鍵合相極性鍵合相指鍵合有機(jī)分子中含某些極性基團(tuán)，與空白硅膠相比，其極性鍵合相表面能量分布均勻，是一種改性的硅膠，常用的極性鍵合相有氨基、氰基等。氨基鍵合相是分離糖類最常用的固定相，常用乙腈-水為流動(dòng)相。二、液相色譜的流動(dòng)相

（mobilephasesofLC）1.流動(dòng)相特性

（1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。

2.流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。3.流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)4.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。樣品種類水溶性HPLC分離方法的選擇相