第四章基因工程的常規(guī)技術(shù)?分離檢測?分子雜交?PCR技術(shù)

?DNA測序

?基因定點突變

?DNA與Pr互作目前一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.1核酸的分離與檢測gDNA的分離質(zhì)粒DNARNA的分離目前二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點細(xì)胞破碎去蛋白DNA沉淀4.1.1gDNA的提取SDS法酚抽提法CTAB法目前三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點CTAB法高鹽:溶解低鹽:沉淀蛋白、多糖分離NaAc-70%alc目前四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點如何保持CS-DNA的完整性?物理降解內(nèi)源DNase＞pH7目前五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.1.2質(zhì)粒DNA的分離純化拓?fù)鋵W(xué)的差異gDNA大,易解旋質(zhì)粒小,ccc狀態(tài)目前六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1.CsCl密度梯度超離心密度梯度沉降=擴(kuò)散浮力密度差樣品+EB樣品BD=該位置上的CsCl密度位置分布:沉降速度、MW及離心時間目前七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點SolI;II;IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2.堿變性法pH12:變性程度pH7:復(fù)性速度離心:收集?目前八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點3.沸水浴法加酶破壁沸水浴40s離心Eth沉淀

目前九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.1.3RNA的提取原理酚-異硫氰酸胍目前十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點防止RNA降解的措施DEPC處理RNasin專用無菌臺器皿、手套、口罩低溫操作目前十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.1.4核酸質(zhì)量檢測紫外光譜法凝膠電泳法[ssDNA]=33(A260A310)

稀釋[dsDNA]=50(A260A310)

稀釋[ssRNA]=40(A260A310)

稀釋熒光分析法二苯胺顯色目前十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點分子篩;電荷效應(yīng)UV→EB→熒光凝膠電泳技術(shù)目前十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點凝膠成像系統(tǒng)目前十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點Rf、分辨力的影響因素大小,構(gòu)型gel濃度電壓、時間buffer凝膠濃度片段大小/kb0.35600.61100.70.8201.00.581.20.40.12目前十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點緩沖液及其pHTBE:緩沖力大?長:TAE﹥TBE?短:TAE分辨力低如何防止pH和離子強(qiáng)度改變?目前十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點RNA的檢測A260變性膠28S→4.5kb18S→2.1kb目前十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點PAGE尿素buffer:0.51TBE同位素或熒光標(biāo)記測序、多態(tài)性分析目前十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點＞40kb:Rf與分子大小無關(guān)交替改變的電場,線團(tuán)→束狀脈沖場凝膠電泳改變形狀所需時間不同膠孔中摩擦力不同A-+AB-+B目前二十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖目前二十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前二十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+目前二十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點影響分辨率的因素脈沖時間(0.1s-1000s):長脈沖,大片段電壓:場強(qiáng)↑,最大片段范圍↑電場夾角:110–120溫度:4℃

目前二十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.2分子雜交技術(shù)SouthernblotNorthernblotWesternblotdotblotFISH菌落原位雜交目前二十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.2.1

探針與探針標(biāo)記寡核苷酸片段ssords足夠長度不含互補(bǔ)區(qū)目前二十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

Mg2+5dNTP5pppdA(-32P-dATP)5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

DNaseIDNApolI1.探針的標(biāo)記目前二十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點隨機(jī)引物標(biāo)記目前二十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點5末端標(biāo)記5

HOOH3

OH5

T4-PNKMg2+

pppATP

(-32P-dATP)5pp5

3

HO3

HOOH3

目前二十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點2.

標(biāo)記物及其檢測標(biāo)記物及性質(zhì)標(biāo)記方法雜交體檢測法地高辛:DIGRPL酶標(biāo)抗體-底物顯色生物素:Bio-16-dUTPNT,TL,PCR酶標(biāo)親合素顯色熒光素:羅丹明,FITC合成法熒光顯微鏡放射性標(biāo)記非放射性目前三十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點地高辛系統(tǒng)標(biāo)記dUTP-連接臂-甾醇半抗原DIG抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物目前三十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前三十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點生物素標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin

Avidin

烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物目前三十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前三十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點熒光素標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG熒光素Biotin

Avidin烷烴連接臂目前三十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前三十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.2.2

Southern雜交質(zhì)粒鑒定、基因位置、分子診斷酶切和電泳法可以嗎?目前三十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前三十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.2.3Northern雜交樣品,電泳,探針?不宜堿變性?勿低鹽buffer洗膜?膠中無EB目前三十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.2.4Western雜交電泳,印跡,免疫學(xué)主要步驟SDS,blot雜交(AP或HRP)目前四十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點Semi-drytransfersystem目前四十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前四十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點斑點雜交4.2.5目前四十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點Allele-specificoligonucleotide(ASO)dot-blothybridizationcanidentifyindividualswiththesicklecellmutation.Theschematicdot-blotattopshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthenormal-globinallele(A-ASO).Theresultsarepositive(filledcircle)fornormalindividualsandforheterozygotesbutnegativeforsicklecellhomozygotes(dashed,unfilledcircle).Thedot-blotatthebottomshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthesicklecell-globinallele(S-ASO),andinthiscasetheresultsarepositiveforthesicklecellhomozygotesandheterozygotesbutnegativefornormalindividuals.TheA-andS-ASOweredesignedtobe19nucleotideslonginthiscasechosenfromcodons3to9ofrespectivelythesenseAandSglobingenesequencessurroundingthesicklecellmutationsite.Thelatterisasinglenucleotidesubstitution(A→T)atcodon6inthe-globingene,resultinginaGAG(Glu)→GTG(Val)substitution(seemiddlesequences).目前四十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點制片探針制備雜交鏡檢、拍照4.2.6

FISH雜交目前四十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點基因檢測新技術(shù)使膀胱癌確診提前“FISH技術(shù)在膀胱癌檢測中的臨床應(yīng)用研究”,為期2年,對4809例患者開展了臨床檢測實驗.結(jié)果:比臨床常規(guī)檢查,膀胱癌確診提前36m雜交探針和檢測試劑已實現(xiàn)國產(chǎn)化,質(zhì)量穩(wěn)定可靠,價格比進(jìn)口產(chǎn)品降低近七成目前四十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.2.7菌落(斑)原位雜交陽性重組子檢測菌落→?文庫菌斑→?文庫目前四十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.3PCR擴(kuò)增技術(shù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)動物單拷貝GSinceitsdiscoveryin1983thepolymerasechainreactionhasrevolutionizedmolecularbiology.Today,newformsofPCRandtherelatedtechniquesofcloningarefindingnewapplicationsatthecuttingedgeofbiomedicine.

目前四十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.3.1基本原理離體合成幾何級數(shù)平臺效應(yīng)目前四十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.3.2反應(yīng)體系模板引物Taq酶dNTPs緩沖液DNAormRNA模板純度數(shù)量目前五十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點引物的設(shè)計1630nt,GC含量連續(xù)互補(bǔ)堿基﹤3

3?正確配對5?可被修飾簡并引物目前五十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點耐熱的DNApolTaq酶Pfu酶?3→5校讀?高保真目前五十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點緩沖液pH、離子強(qiáng)度Mg2+↓,酶活↓Mg2+↑,非特異↑引物退火目前五十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.3.2基本過程變性退火延伸目前五十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點擴(kuò)增精確性的影響因素引物:1mol/LdNTPs:20~200mol/LMg+2:0.5~2.5mmol/Lhotstart目前五十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.3.3PCR技術(shù)的改進(jìn)nestedPCRinversePCRanchoredPCRRT-PCRinsituPCR實時定量PCR目前五十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點1.巢式PCR嵌套引物外引物內(nèi)引物目前五十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點2.

反向PCRX、Y未知序列酶R消化環(huán)化再酶切擴(kuò)增目前五十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點反向PCR的特點難選適當(dāng)?shù)南拗泼笖U(kuò)增的長度有限自身環(huán)化效率低目前五十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點3.AnchoredPCR?錨定引物A?擴(kuò)增?產(chǎn)物鑒定目前六十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點特點擴(kuò)增未知序列無需酶切及連接操作簡單特異性高目前六十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.RT-PCR目前六十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點5.原位PCR原位擴(kuò)增,雜交,定量?不需抽提模板?靈敏度高100?病毒檢測、腫瘤發(fā)生率目前六十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測,實現(xiàn)對起始模板定量分析的方法6.實時熒光定量PCR目前六十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點FRET技術(shù);熒光標(biāo)記探針擴(kuò)增、雜交、光譜、實時檢測熒光信號積累,起始模板量熒光定量PCR的原理目前六十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點起點定量與終點定量起點天然重現(xiàn)性好終點加工誤差大目前六十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點熒光擴(kuò)增曲線的三個階段背景信號階段指數(shù)擴(kuò)增平臺期目前六十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點幾個參數(shù)的確定①臨界點②循環(huán)數(shù)(Ct)③標(biāo)準(zhǔn)曲線基線→閾值→Ct值→DNA0閾值缺省:3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍目前六十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點Log濃度與循環(huán)數(shù)的關(guān)系起始數(shù)越多,Ct值越小標(biāo)準(zhǔn)曲線→樣品Ct值→初始模板量目前六十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記TaqMan探針分子信標(biāo)目前七十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點①SYBRGreen法只有和dsDNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時,DNA雙鏈分開,無熒光目前七十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點延伸結(jié)束階段采集熒光信號與非特異的dsDNA結(jié)合發(fā)光,必須在反應(yīng)結(jié)束時做融解曲線分析目前七十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點SYBRGreen融解曲線分析目前七十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化染料:太高抑制Taq酶活性;太低,熒光信號太弱,不易檢測引物:擴(kuò)增有雜帶,定量不準(zhǔn)Mg2+:1.5mM,減少非特異性產(chǎn)物T&T:由酶和引物決定目前七十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點SYBRGreen法優(yōu)缺點對模板無選擇性使用方便,無需探針靈敏;便宜非特異性結(jié)合,產(chǎn)生假陽性對引物特異性要求較高目前七十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點5-R;3熒光淬滅基團(tuán)(Q)探針完整,R發(fā)射的熒光能量被Q吸收,無熒光;R與Q分開,發(fā)熒光Taq酶:5→3外切酶活性②TaqMan法目前七十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點TaqMan水解型雜交探針原理當(dāng)一個熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊時,供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減,FRET目前七十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點熒光共振能量轉(zhuǎn)移目前七十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點擴(kuò)增1條DNA→釋放1個熒光分子→熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物同步目前七十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點TaqMan法PCR反應(yīng)的建立PP的設(shè)計:探針Tm為70℃,<30bp,5’非G;引物Tm為60℃反應(yīng)參數(shù):

95℃3,94℃15s,60℃60s,40循環(huán)PP優(yōu)化:獲得最小Ct值,最大信號/背景比值primer:

50-900nM;probe:50-250nM目前八十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點TaqMan法優(yōu)缺點對目標(biāo)序列的高特異性引物設(shè)計相對簡單重復(fù)性比較好只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記,價格較高目前八十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點③分子信標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生熒光,信號的強(qiáng)弱→靶序列的多少目前八十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點發(fā)夾型熒光探針R與Q接近,產(chǎn)生FRET探針-模板配對,構(gòu)象改變R與Q分離→熒光目前八十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點熒光定量PCR的特點實時檢測特異性強(qiáng)定量精確無需跑膠目前八十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.4DNA測序化學(xué)降解法末端終止法目前八十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點G反應(yīng):DMS使G、A甲基化G+A:哌啶使G斷裂T+C:肼使嘧啶環(huán)斷開,哌啶除去堿基C反應(yīng):高鹽下,僅C與肼反應(yīng),C末端

1.Maxam-Gilbert化學(xué)降解法目前八十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前八十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點距標(biāo)記末端250nt非酶促合成測序,無需引物對合成的寡核苷酸測序蛋白質(zhì)與DNA的相互作用特點目前八十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點2.Sanger酶學(xué)法目前八十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點基本步驟模板純化測序反應(yīng)模板,引物,Pol,

dNTPs(dd)4個反應(yīng)→4組產(chǎn)物PAGE→自顯影→X光片上樣電泳放射自顯影目前九十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前九十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點測序與PCR的比較測序PCR引物1條1對合成線性指數(shù)底物dNTP和dddNTP產(chǎn)物系列長度片段1條帶目前九十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3.DNA全自動測序同位素標(biāo)記熒光標(biāo)記?單色熒光?多色熒光目前九十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點時間長序列短污染大操作難放射自顯影膠圖目前九十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前九十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點多色熒光標(biāo)記templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTA目前九十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點ABIPrism3100-Avant目前九十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點遺傳分析儀的多種應(yīng)用目前九十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點基本步驟模板的純化與定量測序反應(yīng)—PCR儀產(chǎn)物的純化與變性上樣電泳—測序儀結(jié)果分析目前九十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點AutomatedDNAsequencingwithfluorescentlylabeledddNTP.(A)Thechainterminationreactionsarecarriedoutinasingletube,witheachddNTPlabeledwithadifferentfluorophore.Intheautomatedsequencer,thebandsintheelectrophoresisgelmovepastafluorescencedetector,whichidentifieswhichddNTPispresentineachband.Theinformationispassedtotheimagingsystem.(B)Theprintoutfromanautomatedsequencer.Thesequenceisrepresentedbyaseriesofpeaks,oneforeachnucleotideposition.Inthisexample,agreenpeakisan'A',blueis'C',blackis'G',andredis'T'.目前一百頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前一百零一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.DNA測序技術(shù)進(jìn)展目前一百零二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點傳統(tǒng)測序技術(shù)的缺陷及新進(jìn)展序列不可能太長費時費力準(zhǔn)確度不高結(jié)構(gòu)復(fù)雜序列雜交法質(zhì)譜法DNA芯片法單分子法目前一百零三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前一百零四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.5DNA的定點誘變盒式取代切除;合成;轉(zhuǎn)化olig介導(dǎo)PCR誘變目前一百零五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點olig片段退火合成轉(zhuǎn)化olig介導(dǎo)的誘變目前一百零六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule目前一百零七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點P

C

R

誘變目前一百零八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點目前一百零九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點4.6

DNA與蛋白質(zhì)互作分析Y2HsystemY1HsystemgelretardationassaysDNaseIfootprinting目前一百一十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點1.酵母雙雜交(Y2H)GAL4proteinBD與UAS結(jié)合AD激活lacZ單獨不起作用GAL1UAS啟動子lacZreporter目前一百一十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點G