對心肌肌鈣蛋白自身抗體的抗原表位特異性和IgG子類分布摘要背景:心肌肌鈣蛋白(cTnAAbs)的自身抗體可以干擾心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的測量，這是對心肌梗死的免疫測定。因此，我們確定了cTnl結(jié)合位點和循環(huán)cTnAAbs的IgG子類。方法:通過對健康志愿者的10個ctnaab-陰性和10個ctnaab陽性血清的復合物的檢測，研究了夾層免疫測定的表位特異性。為了研究IgG的子類，我們分析了胸痛患者的入院和3個月的隨訪情況，參照assay測量總IgG(14cTnAAb陰性和14cTnAAb陽性3個月)，以及4個子類特異性的assay測量，只測量IgG子類1-4。結(jié)果:cTnl-陽性樣本中肌鈣蛋白復合物的平均回收率從37%到211%不等，為cTnl中段的最低(aa-30-110)。然而，最低的采樣恢復率，4%-92%，顯示沒有一個研究的表位完全逃脫了ctnaab相關(guān)的干擾。cTnAAb陽性組的8例胸痛患者在采樣點之間呈陽性，根據(jù)所有5個cTnAAb分析，在隨訪中，特異性信號普遍較高。在ctnaab陽性組中，有68%的樣本檢測到IgG4的患病率最高。結(jié)論：IgG亞類研究證實,cTnAAb的形成可能是急性心臟事件的觸發(fā)/增強。關(guān)于cTnAAbs的表位特異性的新信息，應(yīng)該用于重新評價關(guān)于在cTnI分析中使用中期表位表的現(xiàn)有建議。為了避免高度不均勻的cTnAAbs的負面干擾,應(yīng)該考慮使用3個或更多的非常規(guī)選擇的表位。三元肌鈣蛋白復合物，由我、T和C組成，是肌原纖維收縮器械在橫紋肌細胞中的一部分。由于這些細胞內(nèi)蛋白I和T存在于骨骼肌和心肌的不同亞型，在血液中測量心臟特異性等型(心肌肌鈣蛋白)是證明最近或持續(xù)性心肌損傷的最敏感手段。這使心肌肌鈣蛋白成為診斷急性冠脈綜合征(ACS)3(1)的推薦生物標志物。然而，心肌肌鈣特異性自身抗體(cTnAAbs)可以通過心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測這些臨床上重要的生物標志物來干預臨床實踐(2-4)中所使用的ifcc推薦的中間片段方法。cTnAAbs已被發(fā)現(xiàn)高比例(5%-20%)或無心臟疾病(5-10)，而導致自身抗體形成的心臟肌鈣特異性自身免疫反應(yīng)可由心肌損傷后的心肌蛋白釋放引起，例如在炎癥、缺血或心臟毒性治療后。然而，他們的外觀和維護的機制卻鮮為人知。cTnAAbs除了能夠干擾心臟肌鈣蛋白檢測，還具有臨床意義。最近的研究使用小鼠模型，有相關(guān)的循環(huán)ctni特異性cTnAAbs與心臟肌肉炎癥和出現(xiàn)的癥狀表示心臟疾病。這些研究表明，cTnI特異性單克隆抗體(MAbs)的管理誘導野生型小鼠自體免疫擴張型心肌病(11),對cTnI自身免疫反應(yīng)的刺激，而不是cTnT，導致心肌炎癥和心臟功能障礙的增加(12,13)。

此外，在實驗性柯薩奇病毒b3型心肌炎急性期的心臟損傷和cTnl釋放相對溫和，導致cTnAAb形成(14)。在人類身上也研究了循環(huán)cTnAAbs的可能的臨床后果。最近的一項研究(10)表明，cTnAAbs的存在可能會導致ACS患者的cTnl的更高、更長的釋放。另一項關(guān)于ACS患者(15)的研究表明，ctni特異性cTnAAbs可能對左心室功能的恢復有負面影響。然而，一些團體報告說，ctnaab陽性患者的結(jié)果并不低，甚至比ctnaab陰性的患者有缺血性心肌病、擴張型心肌病、心力衰竭和/或ACS(6,16—19)的結(jié)果要好。cTnAAbs在心臟疾病的病因?qū)W上的作用，以及在明顯健康的個體中出現(xiàn)的原因尚不清楚。實際上，心臟肌鈣特異性自身免疫似乎只出現(xiàn)在某些個體中，而絕大多數(shù)的心性病人并沒有發(fā)展它(18,19)。此外，cTnAAbs作為診斷和/或預后生物標志物的可能用途尚不清楚，因為缺乏足夠的長期隨訪研究。由于缺乏關(guān)于人體cTnAAbs分子特性的詳細數(shù)據(jù)，我們本研究的目的是更準確地探索cTnl結(jié)合位點的位置和cTnAAbs的IgG子類分布。材料和方法試劑除了817(國際保健點，),所有的MAbs都是由HyTest(www.hytest.fi)提供的。表1給出了MAbs的總結(jié)和抗原。這些信息是從制造商的包中獲取的。我們從KaivogenOy()和人類心臟肌鈣蛋白(ITC)上購買了一種從HyTest來的心臟肌鈣蛋白。ITC稀釋成Tris-buffered鹽水與疊氮化(TSA)(50更易/LTris-HCl,pH值7.75,150更易與L氯化鈉,0.5g/LNaN3)包含75g/LBSA(微孑L/集,),和股票是儲存在20°C到使用。

jmmarvofMAbsandtheirantigens：.MAbftntigeiniBindin-gisiteP4-14G6Eflnlaa1-1523C0-cTnlaa15-254C2DTnlaa23-26M155Eflnlas28-35WF4eTinlsa34-37sTiril日刊*1-49247eTinI曲35-74seaeTinlaa83—938E10cTiril呂占S6—EK)415eTinI33104-11984eTinlaa117-12BMl46sTirilaa130-1458I7eTinI曲137-1485S1cTnlaa143-152斗密ssTirilaa143-153825cTnl3316S-178472?cTinlaa182-101MF4cTnl站180-195p45-10eTinlaa105-2097B0TnC3D3HumanIgGConstantregion2C11Hum目nIqG1Constantr-egian如果制造商指定了綁定站點或表位。aa,氨基酸。骨胳肌鈣蛋白I的交叉反應(yīng)〉50%。用生物素和鑭系螯合物標記抗體抗體是用生物素標記或內(nèi)在熒光銪(歐盟)螯合如前所述(5),捕獲抗體生物素化的生物素10-30倍摩爾過剩的異硫氰酸酯(禮物Jaana羅森博格,生物技術(shù)學系圖爾庫大學芬蘭)，和檢測抗體被貼上一個25-35-foldEu-chelate摩爾過剩，{2,2’，2‘‘，2'''-{[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethylimino]bis(二)bis{4-{[4-(a-galactopyranoxy)苯基]乙炔基}pyridine—6,2—diyl}bis(methylenenitrilo)}tetrakis(acetato)}銪

(iii)(20)(輻射計/Innotrac診斷Oy,www.innotrac.fi)。生物素化的或歐盟(III)標記馬伯穩(wěn)定了BSA(1g/L)和儲存在4°C。免疫測定法測定ITC復合物的分析恢復通過比較ctnaab陽性樣品的分析回收率和ctnaab-陰性樣品的回收率，確定cTnAAbs在cTnI分子上的結(jié)合位點。我們通過使用各種ctni特異性的MAbs進行捕獲，并使用相同的troponinc-specificMAb作為示蹤劑，測量了每個未加刺的和itc的血清樣品中的熒光信號。首先,300ng生物素化的捕獲是固定化SA-coated微量滴定井25pLKaivogen緩沖溶液與大約1小時孵化環(huán)境室溫。同時,ITC是加入血清整除的最終濃度30pg/LcTnI和孵化1h在4°C。洗后,20pL血清整除(ITC-spiked和未加料的每個血清樣本)和100ngEu-labeled7b9馬伯20pL第二絕緣層(ILII,輻射計/Innotrac診斷Oy)被添加到威爾斯一式三份。1h井被孵化的36°C,900rpm板振動器(iem孵化器/瓶，熱電子/Labsystems,www.)。洗井被干，我們測量了時間分辨熒光直接從表面與維克多X4Multilable計數(shù)器(優(yōu)秀/Wallac,)。最后，我們通過將每個樣本的itc特異性信號與ctnaab-陰性樣品的平均信號進行比較，計算出不同捕獲表位的特定回收率。免疫測定法檢測人體cTnAABs與ILII血清樣本稀釋5倍,從每個prediluted熒光信號測量樣品有無ITC(30pg/LcTnI)。綁定后可能cTnAAbsITC復雜(1h,4°C),30pL樣本和200年pLKaivogen緩沖溶液補充10mg/L本機和5mg/L變性老鼠免疫球蛋白(子午線國際生命科學/生物設(shè)計,)被添加到一式三份SA井preimmobilized100ng的每個生物素化的捕獲抗體(MF44c2,7b9)。1h井被孵化的36°C,900rpm,然后清洗。隨后,Eu-labeled檢測抗體(50-150ng)添加到井200年pLKaivogen緩沖溶液與小鼠免疫球蛋白補充。我們使用MAb3D3作為一個示蹤劑，在總IgG檢測中檢測所有IgG子類和MAbs2C11,3C7,5G12,5C74個子類特異性檢測，分別檢測IgG子類1-4。另一個1h井被孵化的36°C,最后熒光測定。具體信號2100項被視為積極的如果學生學習任務(wù)給一個P值〈0.05時,信號來自相同的樣本有和沒有添加ITC比較。樣品該研究方案得到了當?shù)貍惱砦瘑T會的批準。所有參與者均獲得知情同意書，并按照1975年赫爾辛基宣言的規(guī)定進行了研究，并于2006年修訂。

在2010年至2011年期間，我們在圖爾庫大學生物技術(shù)學院(UniversityofTurku)收集了明顯健康的志愿者(n=20)的血清樣本，進行了表位特異性研究。其中10例為cTnAAb陰性和10cTnAAb陽性，根據(jù)此前發(fā)表的cTnAAbassay(10,21)。簡單地說，血清樣本的cTnAAbs首先被綁定到ITC，而形成的ITC-ctnaab復合物隨后被用150ngbiotinylatedMAbs4C2和MF4進行預固定化。最后，我們發(fā)現(xiàn)捕獲的cTnAAbs有40ng標簽3D3MAb。一個樣本被定義為陰性或陽性，如上所述。我們分析了入院3個月患者的總IgG和IgG子類，以及來自81名非st-抬高ACS患者的28例胸痛患者的血清樣本。從1998年到2000年，在芬蘭的9家不同的中央醫(yī)院采集了樣本，用于對ACS患者克拉霉素治療的安慰劑對照研究，如前所述(22)。樣本儲存在已解凍70°C和前幾次cTnAAb測量。我們使用總IgG分析將患者分為2個研究組:第一個組包括14個ctnaab陰性患者，第二組14個ctnaab陽性患者3個月隨訪。統(tǒng)計分析我們分析了IgG-specific信號采樣點之間的差異與PASW統(tǒng)計18軟件(SPSS,www-01.-/software/analytics/spss)通過魏克森訊號等級測試。所有ctnaab陰性樣本值均為50計數(shù)(最低正信號除以2)，P值〈0.05為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果為了對cTnI分子的cTnAAb結(jié)合位點進行評估,我們用19種不同的cTnI特異性捕獲抗體對ITC恢復進行了測量,并使用相同的troponinc特異性抗體作為示蹤劑。盡管在ctnaab陽性樣本中，所有19個表位樣本中ITC的平均恢復率為89%,但單個cTnI抗原表位的平均恢復值為37%至211%(圖1A)。最低的平均回收率是在c終點站的中段和n端部的表位上獲得的。此外，我們發(fā)現(xiàn)在ctnaab陽性樣本的個體回收率中有相當大的變化:單個表位的最小和最大回收率分別從4%到92%和78%到309%不等。圖1B中3個ctnaab-陽性學科的位點特異性回收率的比較表明，個體間的干擾差異是不同的。ABii?a-1CC-1-15 1^-25 2fi-3E3i-JT41-4$ S3-?3^90也一117- 13&-1ST-143- i?8-■W-1*2-IW-1S6-iTAmABii?a-1CC-1-15 1^-25 2fi-3E3i-JT41-4$ S3-?3^90也一117- 13&-1ST-143- i?8-■W-1*2-IW-1S6-iTAmiM-MuiSiteonthecTnlmolecule(aminoacids)1-1515-2E 3S-3534Q 95-74SMJB6W1iM-117-1弘IJJ-Hi-I4fi-IMl-l￡2-RdIMUSIK14&1161EQS5fi?TB1?1IK209SiteonthecTnlmolecule（aminoacids）圖1所示。ITC對不同的cTnl站點的分析恢復。（A）10個ctnaab陽性樣品的分析回收率。須表示最小和最大的信號;盒子代表第25百分位、中位數(shù)和第75百分位;和廣場代表的意思。⑻在3個ctnaab陽性樣本中，ITC的特異性回收率的一個例子。為了研究cTnAAbs的IgG子類，我們分析了cTnAAbs的總IgG和4個子類特異性的assays。在兩個采樣點上，cTnAAb陰性組的全部14例胸痛患者均為cTnAAb陰性。在14例ctnaab陽性組患者中，6例為陽性，8例為隨訪陽性。這些igg陽性樣本的具體信號為105到69502計數(shù)（中值2111計數(shù)）。如表2所示，ctnaab-陰性組的樣本均未為IgG1或IgG2陽性，但4例入院和5個隨訪樣本對IgG3和/或IgG4（特異性信號125-794計數(shù)，中值242）弱陽性。雖然在ctnaab陽性組中觀察到所有IgG亞類1—4（特異性信號101—115579，中位數(shù)620）,IgG4的患病率最高，在8例入院和11次隨訪中檢測到。此外，入學3和10后續(xù)cTnAAb-positive組陽性樣本同時為2-4子類（表3）。根據(jù)所有5免疫球蛋白測定研究,具體的信號在隨訪相比高出一般入學水平，表明cTnAAb高滴度和/或改進的親和力（圖2）。采樣點之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）,與所有化驗除了IgG3-specific試驗（P=0.249)。Collapseinline|ViewpopupTable2.Prevalence(n)ofclnAAb-positivesampleswithtotalIgGand4subc.las&-sp?cificassaysin2studygroupsatadmissionand3monthsfollow-up.-specificiiycTnAAbnegative=cTnAAb-positive(n=1町Admi^sionmcnthsAdmi-ssionmontlis-nlalIgG00G14Igd□019I痔□Q35lgG3□425lgG443e11Collaps?inline|ViewpopupTable-3.Numberofsampleswith1—4observedIgGsubclassesinthecTnAAb-positiv^shortNumberofobsErvedIgGsubGla^sesper?mplg123斗Admission72193mcrrrths4451

(inlunoo)-Bum覇O_M—peds(inlunoo)-Bum覇O_M—peds圖2所示。cTnAAb信號(Adm)和3個月隨訪(3m)血清來自14個cTnAAb-陰性(A)和14個cTnAAb陽性(B)胸痛患者。ctnaab陰性樣本得到了一個特定的50數(shù)的信號。須表示最小和最大的信號;盒子代表第25百分位、中位數(shù)和第75百分位;和廣場代表的意思。討論目前，cTnAAbs起爆的原因和機制尚不清楚，其臨床和診斷意義尚不明確。雖然cTnAAbs已經(jīng)成為cTnl分析的重要分析機構(gòu)，但其分子特性的詳細數(shù)據(jù)卻很少。因此，本研究的目的在于描述這些自身抗體的表位特異性和IgG亞類分布。我們的表位特異性研究證實了先前發(fā)表的觀察(23)，cTnl分子的穩(wěn)定的中間片段經(jīng)常是cTnAAbs的目標，但也證明了cTnAAb的干擾超出了中間片段，特別是對c端。雖然一些

表位可能不太傾向于ctnaab相關(guān)的干擾，但我們的ITC恢復數(shù)據(jù)為10個ctnaab陽性的樣本顯示，沒有一個被研究的表位完全逃脫了。此外，由于不同個體之間的最大干擾區(qū)域不同，在未來的cTnl分析中應(yīng)該考慮使用3個或更仔細選擇的結(jié)合位點。除了能夠阻止抗體的結(jié)合，觀察到的恢復明顯〉100%意味著cTnAAbs也可以穩(wěn)定一些表位或增強抗體對其結(jié)合位點的親和力。然而，這項研究的結(jié)果證實我們最近發(fā)表的結(jié)論基于抗體配置不同于小說cTnl化驗派生的IFCC-recommendedmidfragment方法改善cTnAAb-positivecTnI檢測樣品，也證明我們的初步假設(shè)cTnl-specific干擾甚至比最初報道更多的異構(gòu)(4)。在取樣點之間，ctnaab陽性組的8例胸痛患者呈陽性。此外，所有5個cTnAAbassays的特定信號通常在指數(shù)事件后3個月。這些數(shù)據(jù)證實心肌肌鈣蛋白在原發(fā)性缺血性損傷時心肌細胞滲漏可能引起自身免疫反應(yīng)導致cTnAAb形成(6,10)。另外，泄漏可以作為先前免疫的助推器，既可以增加血液中的cTnAAb滴度，又能提高自身抗體的親和力。在ctnaab陽性組中，所有IgG子類被檢測到，46%的個體血清對多個子類呈陽性。由于ctnaab陽性樣本的頻率與特定的子類特異性assay有關(guān)，與assay敏感性有關(guān)，因此不可能直接比較這些頻率。然而，值得注意的是，IgG4是在本研究中最常見的cTnAAb(在cTnAAb陽性組中68%的樣本中發(fā)現(xiàn))。IgG4通常是4個IgG子類中最不常見的。因為重復的抗原刺激被認為會促進igg4型抗體的形成，igg4型cTnAAbs的出現(xiàn)表明在急性事件發(fā)生之前，心臟病人的長期心肌肌鈣滲漏可能已經(jīng)發(fā)生。同樣有趣的是，IgG4通常被認為是一種良性和非致病性抗體，在某些過敏反應(yīng)中甚至有積極作用(24)。這兩種觀點都可能與觀察結(jié)果有關(guān)，這是由于半抗體交換反應(yīng)(fab-armexchange)的結(jié)果，大多數(shù)igg4型抗體都是兩種不同抗原結(jié)合位點的雙特異性抗體，使得分子對給定抗原(25)