上次實(shí)驗(yàn)小結(jié)1、觀察自己組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)化平板*培養(yǎng)板在37C培養(yǎng)12-16h衛(wèi)星菌：培養(yǎng)時(shí)間過長2、實(shí)驗(yàn)中的難點(diǎn)*制備效率高的感受態(tài)細(xì)胞o目的DNA片段質(zhì)粒TA載體連接重組質(zhì)粒目的DNA轉(zhuǎn)化無質(zhì)粒的E.Coli死亡有質(zhì)粒的E.Coli存活含抗生素培養(yǎng)基中生長重組質(zhì)粒的鑒定PCR開始上課時(shí)介紹2-3min平板篩選小量制備質(zhì)粒和電泳分析實(shí)驗(yàn)四開始實(shí)驗(yàn)操作前：本次實(shí)驗(yàn)介紹10-15min質(zhì)?！|(zhì)粒載體是存在于細(xì)菌染色體外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，在宿主細(xì)胞內(nèi)可獨(dú)立自主復(fù)制并賦予宿主細(xì)胞一定的遺傳性狀篩選標(biāo)記MCS（多克隆位點(diǎn)）復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒1)培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；2)收集裂解細(xì)菌；3)分離純化質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒提取原理：質(zhì)粒提取有多種方法，但都包含有3個(gè)基本步驟：√去除蛋白質(zhì)√去除基因組DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？質(zhì)粒DNA與基因組DNA的區(qū)別大腸桿菌遺傳物質(zhì)1、部位不同：2、大小不同：質(zhì)粒分子量較小，大小只有普通細(xì)菌染色體DNA的百分之一。基因組DNA分子量較大，細(xì)菌基因組約含3000個(gè)基因，5106

bp?；蚪MDNA容易斷裂線性化堿裂解法提取質(zhì)粒的原理原理：1、強(qiáng)堿和SDS裂解細(xì)菌，細(xì)菌中的質(zhì)粒或基因組DNA在堿性條件下發(fā)生變性。2、怎樣去除基因組DNA？當(dāng)加入酸性物質(zhì)進(jìn)行中和時(shí)，質(zhì)粒DNA很快復(fù)性，

染色體DNA則和變性蛋白質(zhì)等纏繞在一起難以復(fù)性而形成沉淀，經(jīng)離心隨細(xì)胞碎片一起去除；3、怎樣去除蛋白質(zhì)？（已經(jīng)學(xué)過）留有質(zhì)粒DNA的上清，經(jīng)酚和氯仿去除蛋白質(zhì)后,用乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，即得到質(zhì)粒DNA.1)細(xì)胞懸浮液（溶液I）--懸浮菌體50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)細(xì)菌裂解液（溶液II）--裂解菌體0.2mol/L

NaOH1%SDS堿裂解法提取質(zhì)粒試劑：3）中和液（溶液III）----中和NaOH60ml5mol/L醋酸鉀11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase----降解細(xì)菌RNA工作濃度30～50

g/ml其他試劑作用和成分同實(shí)驗(yàn)一。質(zhì)粒DNA的制備錄像5分鐘：（8：20~8：25）（1）（細(xì)菌的收獲：）

取1.5ml工程菌液6,000轉(zhuǎn)/分，離心2min，棄上清。（2）（細(xì)菌的裂解：）

加入200l預(yù)冷的細(xì)胞懸浮液（溶液I）懸浮細(xì)菌加入200l細(xì)菌裂解液（溶液II），顛倒混合離心管內(nèi)容物，待溶液變粘稠為止。注：粘稠：開蓋后出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，證明DNA已經(jīng)游出。（3）（中和：）加入150l中和液，上下顛倒混合后置冰上5min，12,000轉(zhuǎn)/分，4℃離心5min。

堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟開始操作：（去除蛋白質(zhì)）

（4）將上清移至另一離心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等體積的TE飽和的酚/氯仿/異戊醇(25：24:1)混和液，振蕩混勻1min，12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。（5）將上層水相移至另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)溶液，振蕩混勻1min，12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。（沉淀DNA）（6）將上層水相移至另一離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置-20℃沉淀10－15min。１繼續(xù)提取質(zhì)粒：獲取及溶解沉淀的質(zhì)粒DNA2質(zhì)粒DNA電泳分析：（7）12,000轉(zhuǎn)/分離心8min。

棄上清，室溫干燥質(zhì)粒DNA5-10min。（去除RNA）（8）用20l含RNase的水溶解質(zhì)粒DNA，輕輕吹打混合。37℃保溫10min20l質(zhì)粒DNA溶液取出10l放于另一個(gè)離心管中備用剩余10l用于下一步酶切繼續(xù)實(shí)驗(yàn)操作取10

l

的質(zhì)粒DNA加2

l

上樣液混勻。加到0.8%瓊脂糖凝膠的加樣孔內(nèi)。電泳條件：100V40min。電泳結(jié)束后照像保存，結(jié)果分析。質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)粒提取方法質(zhì)粒的量質(zhì)粒的純度要求決定使用不同的方法質(zhì)粒的大小質(zhì)粒過大：溫和裂解質(zhì)粒大小適中：堿裂解，煮沸法如：如：大量提取質(zhì)粒：二次擴(kuò)增細(xì)菌，純化方法要復(fù)雜小量提取質(zhì)粒：單克隆培養(yǎng)，普通堿裂解法質(zhì)粒純度：要求高純度、無內(nèi)毒素等等（滿足各種轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的要求）要求不同的純化方法電泳時(shí)講授10-20min方法樓舉例除：經(jīng)典壯的方治法：Cs軋Cl-溴化以乙錠戀梯度創(chuàng)密度鏈離心特點(diǎn)殘：純艱度最勞高（德可獲脹得高蝦質(zhì)量頌的超呼螺旋蠟質(zhì)粒DN冰A）、癥最貴泉、最室麻煩應(yīng)用宵：大量制備方質(zhì)粒豆；基烘因注詞射，幅基因湯轉(zhuǎn)染繩等對愛質(zhì)粒銅質(zhì)量敵要求死高的鑼實(shí)驗(yàn)缺口猴環(huán)狀勉或線汽狀DN賺A閉環(huán)井質(zhì)粒DN躺A原理器：不研同結(jié)嗽構(gòu)和晃大小馬的DN貞A參入莖的溴樹化乙我錠的膝量不無一樣賄從而捉在Cs滲Cl梯度舍密度晨離心掩中處撤于不凱同的副位置特點(diǎn)變：小往量質(zhì)世粒制醒備、焰最簡懂便、弊快捷應(yīng)用龍：質(zhì)乎粒酶選切鑒嚷定、寸克隆圓（粗刺提）測序帶、轉(zhuǎn)霧染（路細(xì)提夾）質(zhì)粒短提取剩試劑微盒常用蹲方法車：小化量堿樸裂解耳法滿足企不同五需要字的試泉?jiǎng)┖屑兓衷砣梗弘x敞子交截?fù)Q柱拔層析伶等小量講制備貸質(zhì)粒ki白t大量陣制備搶質(zhì)粒ki慢t去除豈內(nèi)毒訓(xùn)素制黑備質(zhì)返粒ki魂t可用趙于大草部分刷分生弊實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒樓的電推泳質(zhì)粒DN壩A的3樂種形悅式泳欠動(dòng)速里度:繪超螺扯旋>側(cè)線性塌>開總環(huán)質(zhì)粒DN評A的存倍在形工式有往3種串:1、共價(jià)棉閉環(huán)DN軌A:常以殘超螺撐旋形等式存狐在2、開環(huán)DN委A:質(zhì)粒DN資A兩條州鏈中濫有一宮條發(fā)萄生一阻處或歐多處陰斷裂溜，因發(fā)此可奔以自桌由旋不轉(zhuǎn)從繞而消友除張貪力,形成施松弛鏟的環(huán)恨狀分蘿子3、線性DN叫A:因質(zhì)獲粒DN席A的兩藝條鏈勻在同幫一處銷斷裂劍而造滑成.開環(huán)超螺勁旋線性重組落質(zhì)粒城的鑒理定平板怪篩選眉：大覆多數(shù)辜情況餃下，亞平板落篩選晶只能方區(qū)分駝含有槍或未贊含有詞質(zhì)粒序的細(xì)斬胞，湊卻無依法區(qū)籃分含煉有空死質(zhì)粒礙或重婦組質(zhì)銀粒的哀細(xì)胞提取胃的質(zhì)平粒質(zhì)粒株電泳驕篩選